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《志賀菌外排泵基因emre的克隆表達及進化分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應用文檔-天天文庫。
1、志賀菌外排泵基因emrE的克隆表達及進化分析作者：吳健張少平穆瑞瑞丁毅郗園林段廣才【摘要】目的研究志賀菌外排泵基因emrE的耐藥功能及其進化。方法以志賀菌臨床多重耐藥株H24基因組為模板，擴增出含emrE基因的1126bpDNA片段，將所得片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，對陽性克隆酶切鑒定和測序；用瓊脂平皿二倍稀釋法對重組菌株進行藥敏測定并測定泵抑制劑CCCP對MIC值的影響；通過RT-PCR從mRNA水平檢測emrE的表達水平；通過Genbank數(shù)據(jù)庫對基因序列進行同源性比對，建立進化樹并
2、分析同源基因之間的關(guān)系。結(jié)果含emrE基因質(zhì)粒可以提高大腸埃希菌對四環(huán)素耐藥性1倍，對紅霉素的耐藥性1倍；對emrE基因的同源分析顯示H24菌株和大腸埃希菌、其它志賀菌可歸為相近一族，同源性在92%以上，與同屬于腸桿菌科的歐文桿菌和沙門菌的同源性分別為70%和60%；與親緣關(guān)系較遠革蘭陽性菌除蟲鏈霉菌和結(jié)核分枝桿菌的同源性僅為47%和48%。結(jié)論志賀菌耐藥株H24的emrE基因與對四環(huán)素及紅霉素的耐藥性相關(guān)，依據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)進行的emrE基因同源分析未發(fā)現(xiàn)有明顯的基因水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。【關(guān)鍵詞】志賀菌；emrE基因；外排
3、泵；耐藥；基因水平轉(zhuǎn)移ABSTRACTObjectiveTostudythefunctionandphylogeicsoftheactiveeffluxpumpgeneemrEinclinicalisolatesofShigella.MethodsTheactiveeffluxpumpgeneemrEplifiedbyPCRandligatedidtoconstructtherebinantpMD-emrE,andthepMD-emrEedintoE.coliDH5α.Thepositivebacterialcl
4、onesedigestion,andthegeneofisolatesethod;phylogenictreeGenbank.ResultsPlasmidpMD-emrEcanelevatetheresistancelevelofE.colitotetracyclinbyonefoldanderythromycinbyonefold.AnalysisofemrEphylogenictreeindicatedthatstrainH24,allstrainsofE.coliandallotherstrainsofSh
5、igellacouldbeclassifiedintoonegrouponella,ycesavermitilisandMycobacteriumtuberculosisrEycininthedrugresistancestrainH24.PhylogenictreeanalysisindicatesitrEtodevelophorizontalgenetransferringamongdifferentbacterialgenomes.KEYR)。SMR耐藥泵家族是已知細菌中最小的多重耐藥外排泵。通常由100多
6、個氨基酸組成，形成四個跨膜螺旋。前3個跨膜螺旋為雙親性，含有許多保守的谷氨酸、絲氨酸、酪氨酸及色氨酸殘基，這些殘基的側(cè)鏈與底物的疏水區(qū)域直接作用而介導它們的跨膜轉(zhuǎn)運。SMR轉(zhuǎn)運蛋白為PMF能量來源型(第二類主動外排系統(tǒng))［10］。SMR家族成員均來自于細菌，其中最典型的是大腸埃希菌的EmrE泵。通過對大腸埃希菌的EmrE泵研究發(fā)現(xiàn)SMR耐藥泵是通過多聚體的形式發(fā)揮功能的，形成同源三聚體［11，12］或四聚體［13］。目前已在多種菌株中發(fā)現(xiàn)emrE外排泵基因的分布，但其序列有較大差異，其進化意義和生理意義尚不十分明
7、了。大腸埃希菌中emrE編碼的外排泵蛋白能引起對甲基紫精、四苯溴化磷、溴化乙啶、吖啶黃、結(jié)晶紫及紅霉素、四環(huán)素和磺胺嘧啶等的耐藥性［14，15］。本文報道克隆了包括調(diào)控序列在內(nèi)的完整志賀菌emrE耐藥泵基因，并在大腸埃希菌中測定了它的耐藥特性，同時初步分析了該基因在細菌中的分布和進化關(guān)系，為近一步進行耐藥性研究奠定了基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料(1)菌種及質(zhì)粒大腸埃希菌DH5α及臨床分離志賀菌多重耐藥株H24由鄭州大學公共衛(wèi)生學院流行病教研室收集保存；大腸埃希菌藥敏質(zhì)控株ATCC25922由河南省疾病預防控制中心
8、惠贈；pMD18-T載體購自大連TaKaRa公司。pMD18-T載體由pUC18改建而成，在pUC18載體的多克隆位點處的XbaI和SalI識別位點之間插入了EcoRV識別位點，用EcoRV進行酶切后，再在兩側(cè)的3′端添加“T”而成。它易于與PCR產(chǎn)物聯(lián)接并與pUC18具有相同的功能，選擇標記為氨芐西林抗性基因，通常用作克隆載體，但也能適度表達。(2)工具酶及試劑SacI
