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《肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(lcmr1)相互作用蛋白的篩選與鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
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2、軍醫(yī)進修學(xué)院研究生學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明秉承我院“敬業(yè)、勤奮、求實、創(chuàng)新’’的學(xué)風，本人聲明：所呈交的論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得我院或其他教育機構(gòu)的學(xué)位及證書而使用過的材料，對本文的研究作出貢獻的個人或集體，均已在文中做了明確的說明并表示謝意。申請學(xué)位論文與資料若有不實之處，本人承擔一切相關(guān)責任。論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：：加【0軍g-日fg日：3-olo卑}閏f8J丑研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人保證畢業(yè)離院
3、后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時署名單位為軍醫(yī)進修學(xué)院或解放軍總醫(yī)院。學(xué)院有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文原件、復(fù)印件和電子版本，可以采用影印、縮印、掃描或其它手段保存論文以供被查閱和借閱。學(xué)院可以公布學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容(保密內(nèi)容除外)。論文作者簽名指導(dǎo)教師簽名期：≯o(o繹}目f8日期：2ofo年歲f丑lg日●_目錄中文摘要?????????????????????????(1)英文摘要?????????????????????????(3)前言?????????????????????????(5)翮看?“?“????“?“???“??“????
4、??”??。(5．)第一部分酵母雙雜交技術(shù)篩選LCMRI相互作用蛋白第一節(jié)誘餌質(zhì)粒的鑒定?????????????????????(8)第二節(jié)95D細胞cDNA文庫的構(gòu)建???????????????(23)第三節(jié)共轉(zhuǎn)化實驗及陽性克隆的鑒定??????????????(30)第二部分蛋白相互作用的細胞內(nèi)驗證第一節(jié)標簽質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定?????????????????(39)第二節(jié)標簽質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞??????????????????(51)第三節(jié)免疫共沉淀反應(yīng)及WesternBlot檢測????????????(58)第三部分蛋白相互作用的體外驗證第一節(jié)誘餌質(zhì)粒
5、的原核表達與純化???????????????(67)第二節(jié)捕獲蛋白的體外轉(zhuǎn)錄翻譯????????????????(74)第三節(jié)GST融合蛋白沉降反應(yīng)?????????????????(79)結(jié)論????·???????????????·??·????(87)參考文獻??????????????????????????(88)文獻綜述蛋白質(zhì)相互作用的研究策略??????????????(92)英文縮略詞表????????????????????????(100)攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況??????????????????(101)致謝?···一·：?·?··??
6、···????????????“·?·?·····(102)●．-肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白l(LCMRl)相互作用蛋白的篩選及鑒定中文摘要目的：肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(1ungcancermetastasisrelatedprotein1，LCMRI)的編碼基因是我們實驗室采用差異顯示技術(shù)克隆到的新基因(GenBankID：AYl48462)，目前其生物學(xué)功能不明確。本實驗擬通過蛋白一蛋白相互作用研究，尋找與LCMRl相互作用的蛋白，為進一步研究LCMRl基因的功能及其在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供線索和分子基礎(chǔ)。方法：(1)將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LCMRl轉(zhuǎn)化入酵母菌，檢
7、測誘餌質(zhì)粒有無轉(zhuǎn)錄激活活性和宿主毒性，鑒定BD-LCMRI融合蛋白的表達情況。(2)以95D細胞總RNA為模板，采用SMART技術(shù)在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成eDNA第一鏈，使用長距離PCR擴增dscDNA片段．(3)將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LCMRI、95D細胞eDNA文庫片段及線性化質(zhì)粒pGADT7-Ree共轉(zhuǎn)化酵母菌AHl09，用營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基初步篩選陽性克?。?4)通過反復(fù)劃線培養(yǎng)及重復(fù)檢測報告基因激活等方法，去除假陽性克隆。(5)提取陽性克隆質(zhì)粒，分離并擴增單個文庫質(zhì)粒。將pGBKT7-LCMRI誘餌質(zhì)粒和單個文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌AHl09，驗證其相互作用
8、。(6)回復(fù)驗證為陽性的質(zhì)粒測序并進行生物信息學(xué)分析．(7)應(yīng)用免疫共沉淀(CO-IP)技術(shù)在細胞內(nèi)對酵母雙雜交結(jié)果進行驗證，確認蛋白質(zhì)相互作用。(8)應(yīng)用融合蛋白沉降(GSTpul卜down)技術(shù)在體外對其結(jié)果進一步驗證，確定蛋白質(zhì)相互作用．結(jié)果：(1)誘餌質(zhì)粒pGBKT7-LCMRl測序鑒定正確，經(jīng)檢測誘餌質(zhì)粒無自激活作用和宿主毒性，Westernblot實驗證實誘餌質(zhì)?？稍诮湍钢姓_表達融合蛋白BD-LCMRI。(2)以95D細胞總RNA為模板合成dseDNA，產(chǎn)物純化后痙1．2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察到一條明亮的彌散狀條帶，大小在250bp一6000b
9、p，符合文庫構(gòu)建要求。(
