應(yīng)用精子載體法生產(chǎn)轉(zhuǎn)sap基因巴馬小型豬的初步的的研究

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1、響，重復(fù)六次，以比較不同孵育時間對精子活率、平均曲線運動速度(VCL)、平均直線運動速度ⅣSL)、平均路徑速度(VAP)、前向性(STR)等試驗指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示孵育1h的精子活率、STR與0h(對照組)比較無顯著性差異(p>o．05)，但VAP、VSL和VCL有顯著差異；而孵育2h與對照組比較除VsL無顯著性差異外，其余各項指標(biāo)差異均顯著。表明外源DNA與精子孵育1h，對精子質(zhì)量無顯著性影響，但孵育2h精子質(zhì)量顯著下降。試驗二研究不同DNA劑量對轉(zhuǎn)染后精子質(zhì)量影響，試驗分別加入標(biāo)記的DNA(1ng／燦

2、)片段o}IL(對照組)、lOIJlL和20IjLL三處理組，試驗考查指標(biāo)和重復(fù)數(shù)同試驗l。結(jié)果顯示各組精子的活率和運動曲線等均沒有顯著差異，表明外源DNA的添加對精子質(zhì)量無顯著影響。試驗三研究分別加入獲能液和對照PBS液(對照組)對轉(zhuǎn)染后精子質(zhì)量影響，試驗方法和指標(biāo)同試驗l，重復(fù)六次。結(jié)果顯示加入受精液后精子各項試驗指標(biāo)均有顯著變化。試驗四分別用共孵育后的精液和對照組不含外源DNA的新鮮精液進(jìn)行豬人工授精，以比較轉(zhuǎn)染豬精子的人工授精效果。結(jié)果對照組和試驗組各有一頭母豬妊娠，其中精子共孵育后處理的妊娠母豬

3、雖產(chǎn)下仔豬11頭，但經(jīng)紫外光檢測未發(fā)現(xiàn)有綠色熒光標(biāo)記后代。本研究獲得如下結(jié)論：(1)試驗成功構(gòu)建pEGFP．N1．SAP真核載體并在NlH．3T3細(xì)胞中得到轉(zhuǎn)染表達(dá)；(2)在精子與外源DNA共孵育過程中，以1h對精子質(zhì)量效果無顯著性影響；(3)外源DNA添加10．20n∥IJLL量對精子質(zhì)量無顯著影響；(4)添加獲能液后精子運動速度和活率顯著提高，有利于外源DNA進(jìn)入精子體內(nèi)；(5)初步建立精子載體法生產(chǎn)巴馬小型豬轉(zhuǎn)SAP基因豬技術(shù)體系，但其效率還有待提高。關(guān)鍵詞：巴馬小型豬血清樣淀粉P物質(zhì)轉(zhuǎn)基因豬精子載

4、體法PRELEMINARYsTuDYONTHEPRoDucTIoNoFsAPTRANSGENICBAMAMINI—PIGBYTHESPERMMEDIATEDGENETRANSFERABSTRACTInthisstudymemethodofmolecularcloningalldspe吼medlatedwasusedtoexploret11eef．fect0fsemman搿10idPcomponents(SAP)geneclonmg，recombinantexpressionofeu哪oticplasmid

5、andspennwithexogenousDNAincubationconditionsonthespe肌qual塒，inordertoestablishatecllnlcalplatfornlofproductionofspem-mediatedgenetrallsfer(SMTG)methodmsAPtransgenicB鋤amini—pig．Thisthesisincludesthreechapters·Thefirstch印tersisthereviewofliteraturesandthesec

6、ondandthirdchaptersaretne111thesecondchapter，theSAPgenecloningandmeestablishmento置仕坨eukaryoticexpression，transfeCtandidentificationwerec耐edout1nordertoDrovideformenextcha講ertheexogenousDNA矗貿(mào)meproductlonots，蚶t啪sgenicB鋤amini-pigbySM[TGmethod．Apairofspecific

7、pnmerswasdesi聃edaCcord噸t0theSAPsequenceinGenBankandthereVerse1)olymeraSechainreaction(I汀一PCI◇wasperf-ormedt0鋤p11士ythecorrespondingcDNA仔a腫entusingtheb鋤amini。pigliVertissue洲RNAasatemplateandthen也eamlified脅gIllentshowedareStrictionsltesmtheSAPgenewhichwascor

8、nlectedtothepMD18一TVectora11dtransfectedtoDH5abacteria，andthetestedpositivebaCt撕anliquidwassequenced·ThesequenclngresultsshoWedthatthelen酗ofBamamini—pi薩SAPgenef．ragment1s675bp‘Thehomologywasl00％comparedwiththegeneGe