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《禽戊型肝炎病毒中國分離株orf3蛋白抗原表位分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文禽戊型肝炎病毒中國分離株ORF3蛋白抗原表位分析姓名：胡守彬申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：周恩民20120615山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩上學(xué)位論文中文摘要2001年，Haqshenas等從患有肝脾腫大(Hepatitis—splenomegaly,HS)綜合癥的雞膽汁中首次分離和描述了禽HEV的全基因組序列。2010年，趙欽等首次分離并描述了國內(nèi)禽HEV的全基因組，序列分析發(fā)現(xiàn)與其它國家禽HEV的同源性為77．3％一95．5％。禽HEV感染主要引起30—70周齡的蛋雞和
2、肉種雞的死淘率升高(1％)和產(chǎn)蛋率下降(20％．40％)，感染雞通常腹部紅腫，卵巢退化，偶有雞肝脾腫大、肝壞死和出血。血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病毒的感染在許多國家中已廣泛流行，而我國部分地區(qū)的雞群血清陽性率也達(dá)到了30％左右。禽HEV屬于肝炎病毒屬，為單股正鏈RNA，基因組全長約6．6kb，包含三個開放閱讀框：ORFl，位于基因的5’端，編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2，位于基因的3’端，編碼病毒衣殼蛋白；ORF3與ORF2部分重疊，對其研究很少。本研究針對禽HEVORF3蛋白，進(jìn)行了整段與分段原核表達(dá)，將
3、表達(dá)獲得的完整ORF3蛋白免疫小鼠，利用常規(guī)的雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備與篩選單抗，獲得三株穩(wěn)定分泌抗ORF3蛋白的雜交瘤細(xì)胞系，命名為6E9、3F3、2C9，其亞型分別為IgGl、IgG2b、IgGl，間接ELISA與Westernblot檢測結(jié)果顯示，三株單抗識別的抗原表位均位于ORF3蛋白C端74aa．88aa，競爭ELISA結(jié)果顯示，3F3與2C9識別同一抗原表位，而6E9與前兩者共享部分抗原表位。同時我們利用分段蛋白對臨床存在ORF3蛋白抗體陽性的雞血清進(jìn)行了ELISA和Westernblot檢
4、測。實驗結(jié)果顯示臨床血清中存在針對1-27aa、55。74aa和74．88aa三個抗原區(qū)的抗體。而將陽性雞血清分別與三株單抗的競爭ELISA結(jié)果顯示，44％的陽性血清中存在與2C9識別同一表位的抗體。為進(jìn)一步研究ORF3蛋白的不同抗原區(qū)，我們利用桿狀病毒表達(dá)體系真核表達(dá)了ORF3蛋白，經(jīng)SDS．PAGE分析、Westernblot和間接免疫熒光(IFA)檢測，結(jié)果表明，ORF3蛋白在昆蟲細(xì)胞sf9中成功獲得了表達(dá)。將純化的蛋白免疫小鼠，成功制備了ORF3蛋白的多抗血清，將該血清分別與原核表達(dá)的分段
5、蛋白進(jìn)行ELISA與Westernblot反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該血清識別的抗原位點集中在aa74．88。綜合上述實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，禽HEVORF3蛋白的主要免疫顯性抗原區(qū)位于蛋白C端的aa74．88位置，而1-27aa和55-74aa區(qū)域其抗原性較弱。已有研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物HEV除了ORF2蛋白含有病毒主要的抗原表位，其ORF3蛋白也含有可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的抗原表位，且目前ORF3蛋白已經(jīng)廣泛應(yīng)用于哺乳禽戊型肝炎病毒中國分離株ORF3蛋白抗原表位分析動物HEV的臨床抗體檢測。哺乳動物HEVORF3的功能性
6、研究也已開展很久，一直是研究熱點。本實驗首次針對禽HEVORF3進(jìn)行研究，主要針對其抗原性進(jìn)行了探討，制備的單抗有較高生物學(xué)特性具有良好的應(yīng)用價值，真核表達(dá)了禽HEVORF3蛋白，具有一定的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步研究禽HEVORF3的蛋白結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：禽HEV；ORF3基因；抗原分析2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文AnalysisofORF3ProteinEpitopesofAvianHepatitisEVirusChinaIsolateAbstractIn2001，avianhepati
7、tisEvirus(HEV)wasisolatedandcharacterizedfrombilesofchickenswithhepatitis-splenomegaly(HS)syndromebyHaqshenaseta1．In2010，theChinesestrainofavianHEVwasfirstisolatedbyZhaoQinandthefulllengthsequencesofthisisolatesharedapproximately77．3％一95．5％nucleotides
8、equenceidentites誦tllthoseofotheravianHEVstrains．AvianHEVinfectioncauseshepatitis·splenomegalysyndrome，hepatonecrosis，hepatichemorrhage，regressiveovariesandupgrademortalityforchickens．AvianHEVinfectionisendemicinchickenflocksandhasspreadtoNorth
