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《具有殺松材線蟲活性細菌的篩選和鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、引言松材線蟲病[Bursaphelenchusxylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle]，又稱松樹萎蔫病，是松樹的一種毀滅性病害，主要由松墨天牛傳播【l】，已在日本、中國、韓國和葡萄牙等國家造成了巨大損失，因此該病已成為世界上許多國家最重要的植物病蟲害檢疫對象[21。由于該病缺乏特別有效的防治措施‘31，目前主要是采取化學防治。但化學農藥存在持效性較差、成本高、易產生抗藥性、對環(huán)境污染嚴重等問題，化學藥劑的應用正在逐步受到限制。因此，松材線蟲病的生物防治已成為該病研究的一個重要發(fā)展方向，針對松材線蟲的生物防治，主要是殺線活性的生防植物和生防微生物的研究。櫧
2、。Oh等【21】通過建立的高通量篩選技術，篩選T206種化合物的殺線活性，發(fā)現一種水溶性的化合物(1-n-undecyl-2一【2-fluorphenyl]methyl-3，4-dihydro-6，7-dimethoxy-isoquinoliniumchloride)具有良好的殺線活性。此外，一些植物提取物也被證明具有殺線活性。捕食線蟲真菌是自然界中廣為分布的線蟲天敵，這類真菌能產生各種捕食器官捕食線蟲。Saiki等【4J從松樹汁液中分離到一種捕食能力很強的捕食性真菌一節(jié)叢孢屬真菌(Arthrobotryssp．)，林間試驗證明用該菌噴灑黑松和赤松幼林，對防治松材線蟲病具有一定的
3、效果。W觚g等【51研究--(Drechslerelladactyloides的兩個菌株，發(fā)現均具有很高的捕食能力，其中一個菌株接種后24h對松材線蟲的捕捉率可達100％。Wang等t22】從森林土壤中感病的線蟲體內分離出了Evermicola的多個新菌株，生測表明其中一個菌株在4～5d內就能感染致死幾乎全部的供試松材線蟲，溫室試驗*D2年的林問試驗發(fā)現接種的真菌能在松樹內生長并感染松材線蟲，證明該菌能有助于松樹抵抗松材線蟲的侵染，有希望成為防控毀滅性的松材線蟲病的生防菌。目前已報道的對線蟲有生防作用的微生物主要有捕食線蟲真菌‘4-引，內寄生真菌‘61、產毒真菌[3,7-8]、殺
4、線放線菌‘9圳1和殺線細菌[1H5】，它們多數來源于陸生環(huán)境，少數分離白淡水生境。近年來，對具有殺松材線蟲活性的海洋微生物研究有了一定的進展。雷敬超等【loJ從海洋環(huán)境樣品中分離和篩選出一株鏈霉菌(Streptomycessp．)，其發(fā)酵濾液稀釋10倍后仍可使松材線蟲校正死亡率達到68．9％。鄭海營等【16j從青島近海海域采集的樣品中分離和篩選出對松材線蟲具有較強殺線活性的青島大學碩士學位論文2株巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。Meng-等‘17峙艮道了一株具有較強殺松材線蟲活性的海洋真菌(Acremoniumsp．)。本研究擬利用日常生活環(huán)境中的微生物資源
5、，通過對腌制芥菜的體表和變質竹筍中的細菌分離和菌株殺線活性測定，以篩選出對松材線蟲具較強殺線活性的細菌，為松材線蟲病的生物防治提供生物材料和理論基礎。．第1章一株具有殺松材線蟲活性細菌的篩選和鑒定材料與方法1．1主要材料及試劑松材蟲[Bursaphelenchusxylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle]：由南京林業(yè)大學森林資源與環(huán)境學院昆蟲實驗室提供。實驗菌種：從腌制芥菜的表面分離所得。營養(yǎng)瓊脂(NutrientAgar)和營養(yǎng)肉湯(NutrientBroth)為北京陸橋技術有限責任公司的生產，馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)，乙酸乙酯。1．2主要儀器設備表1
6、主要實驗儀器設備一覽表青島大學碩+學位論文1．3實驗方法1．3．1松材線蟲的培養(yǎng)按照配方配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，121℃滅菌20min后倒平板，接種灰葡萄孢(Botrytiscinema)。無菌松材線蟲參照鄭海營文獻【16]中的方法獲得，松材線蟲的培養(yǎng)參照文獻【17】的方法進行，在無菌操作臺內將灰葡萄孢(Botrytisc砌P贈∞接種于平皿中的PDA培養(yǎng)基上，置25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當灰葡萄孢菌絲長滿培養(yǎng)基時接入無菌松材線蟲，25℃繼續(xù)培養(yǎng)。定期觀察，菌絲逐漸消失，培養(yǎng)基表面長滿松材線蟲，即可收集松材線蟲用于生測分析。1．3．2菌種采集用無菌水沖洗芥菜體表，沖洗液采用稀釋涂
7、布法涂在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進行分離，在28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后根據菌落形態(tài)的差異選擇代表性菌株，將所得的菌株純化三次后接入斜面培養(yǎng)基中，4℃保存?zhèn)溆谩?．3．3細菌濾液的殺線活性及其熱穩(wěn)定性測定(11取細菌的培養(yǎng)濾液0．3mL放入1．5mL的無菌離心管中，另外向離心管中接入O．3mL約600條線蟲，混勻后，每隔2h觀察松材線蟲的死活情況，以不接菌的液體培養(yǎng)基濾液為對照。處理后線蟲死活的觀察方法為：用微量移液器取30p．L含線蟲的混合液于載玻片上，置于體視顯微鏡下觀察，線蟲死亡
