foxp3在鼠黑素瘤細(xì)胞中的表達(dá)及功能的初步研究

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1、軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院解放軍總醫(yī)院碩士學(xué)位論文Foxp3在鼠黑素瘤細(xì)胞中的表達(dá)及功能的初步研究姓名：陳殿君申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：杜楠2012-05-29軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文Foxp3在鼠黑素瘤細(xì)胞中的表達(dá)及功能的初步研究中文摘要惡性黑色素瘤(惡黑)是一種來源于黑色素細(xì)胞的高度惡性腫瘤，其對放化療不敏感，且耐藥率也是最明顯的一種。近年來，臨床應(yīng)用腫瘤免疫治療惡黑取得顯著效果，通過腫瘤疫苗和DC細(xì)胞、CIK細(xì)胞等回輸治療，促進(jìn)體內(nèi)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量增加，從而攻擊并破壞腫瘤細(xì)胞。但體外實驗表明，黑色素腫瘤組織中活化的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量較預(yù)

2、期數(shù)量有所減少，且不能有效破壞腫瘤細(xì)胞。由此現(xiàn)象，人們認(rèn)識到惡黑腫瘤微環(huán)境中存在免疫耐受機(jī)制，腫瘤細(xì)胞可通過某些機(jī)制誘導(dǎo)自身免疫耐受從而實現(xiàn)腫瘤免疫逃逸。自1995年Sakaguchi等[11首先提出CD4+CD25+Treg之后，引起了免疫學(xué)界越來越多的關(guān)注。大量實驗研究表明，CD4+CD25+Treg可通過抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞來維持免疫耐受，同時也抑制了腫瘤抗原特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞發(fā)揮有效的抗腫瘤應(yīng)答。Foxp3作為Treg的特異性分子標(biāo)志，在調(diào)控CD4+CD25+Treg的發(fā)育上起很著重要作用。Foxp3分子的表達(dá)曾被認(rèn)為嚴(yán)格限制于T細(xì)胞系。近年來

3、，在體外研究中發(fā)現(xiàn)Foxp3在其他人腫瘤細(xì)胞(腸癌、肺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤細(xì)胞等)和組織中均有不同程度的表達(dá)。目前，對Foxp3的研究多集中在人的腫瘤，而在鼠系的腫瘤中的研究較少。因此，我們推斷Foxp3分子也可／月-w匕_．表達(dá)于小鼠黑色素瘤細(xì)胞，并參與維持黑色素瘤腫瘤微環(huán)境的免疫耐受。針對以上假設(shè)進(jìn)行以下實驗。目的：證實小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞是否表達(dá)Foxp3，研究其對效應(yīng)T細(xì)胞的增殖和功能的抑制作用。方法：通過實時熒光定量PCR檢測小鼠黑色素瘤細(xì)胞中Foxp3mRNA表達(dá)水平；通過Westernblot和流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠黑色素瘤細(xì)胞中

4、Foxp3蛋白的表達(dá)；通過免疫熒光檢測小鼠黑色素瘤細(xì)胞中Foxp3分子的表達(dá)；檢測干擾Foxp3后免疫抑制相關(guān)分子表達(dá)量的變化及對CD4+CD25‘T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果：證實在小鼠黑色素瘤細(xì)胞中存在Foxp3的mRNA轉(zhuǎn)錄和分子表達(dá)；免疫熒軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文光顯示Foxp3分子定位于黑色素瘤細(xì)胞的胞核及核周部位。通過Foxp3siRNA的轉(zhuǎn)染，可實現(xiàn)對B16細(xì)胞Foxp3表達(dá)的沉默，可下調(diào)腫瘤細(xì)胞對CD4+CD25‘T淋巴細(xì)胞增殖抑制的能力，并且下調(diào)TGF—pl、TGF．p2和IL．10等細(xì)胞因子的表達(dá)，尤其是TGF-B2的表達(dá)。結(jié)論：小鼠

5、B16細(xì)胞表達(dá)Foxp3，利用RNA干擾技術(shù)可抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞靶基因Foxp3的表達(dá)，并對CD4+CD25’T淋巴細(xì)胞增殖抑制的能力減弱，同時減弱抑制性細(xì)胞因子的分泌。綜上所述，腫瘤細(xì)胞所引起的CD4+CD25+Treg細(xì)胞產(chǎn)生及功能增強(qiáng)是腫瘤逃避免疫監(jiān)視機(jī)制之一，而黑素瘤細(xì)胞Foxp3的表達(dá)可能成為黑素瘤腫瘤微環(huán)境抑制自身免疫系統(tǒng)的一種新機(jī)制。因此深入研究Foxp3在黑素瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制將為黑素瘤的免疫治療提供新靶標(biāo)和新的治療策略。[關(guān)鍵詞]：黑色素瘤，F(xiàn)oxp3，慢病毒，表達(dá)，功能2軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文PreliminaryStudyofTh

6、eExpressionandFunctionofFoxp3inMurineMelanomaCellsAbstractMalignantmelanoma(melanoma)isahighlymalignanttumorderivedfrommelanocytes．Itisnotsensitivetothechemotherapy，andtheoccuranceofdrugresistanceisverycommon．Inrecentlyyears，theapplicationoftumorimmunetherapyinclinicalachievedrema

7、rkableachievements，promotedthenumberofinvivotumorantigen-specificYcellstoattackanddestroytumorcellsthroughtransfuseiontherapyoftumorvaccineandDCcells，CIKcells．Butinvitroexperimentsshowedthatthenumberoftumorantigen—specificT-cellactivationinthemelanomatumortissueisdecreased，andCann

8、otdestroytumorcellseffectively．Th