具有成骨誘導(dǎo)活性新型融合蛋白實(shí)驗(yàn)的研究

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1、第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文縮略語表縮略語英文全稱中文全稱ALPAlkalinephosphatase堿性磷酸酶BMPBonemorphogeneticProtein骨形態(tài)發(fā)生蛋白bBMPbovineBMP牛骨形態(tài)發(fā)生蛋白DMEMDulbeco’smodifiedeaglemediumDulbeco改良MEM培養(yǎng)基EGFPEnhancedgreenfluorescenceprotein增強(qiáng)型綠色熒光蛋白IPTGIsopropy-β-D-thiogalactoside異丙基-β-D-硫代半乳糖苷FSFibrinsealant纖維蛋白膠LMP

2、LIMmineralizationproteinLIM礦化蛋白MSCMarrowstromalcell骨髓基質(zhì)細(xì)胞PTDProteintransductiondomain蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能域rhBMP-2recombinanthumanBMP-2重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白R(shí)T-PCRReversetranscriptionpolymerase反轉(zhuǎn)錄PCRchainreactionSmadSma-andMad-relatedproteinSma和Mad相關(guān)蛋白SmurfSmadubiquitinregulatoryfactorSmad泛素化調(diào)節(jié)因子

3、TGF-βTransforminggrowthfactor-β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TATTrans-activatortranscription轉(zhuǎn)錄反式激活因子1第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明秉承學(xué)校嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶W(xué)風(fēng)與優(yōu)良的科學(xué)道德，本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，不包含本人或他人已申請(qǐng)學(xué)位或其他用途使用過的成果。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了致謝。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有

4、不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名：日期：保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)聲明本人完全了解第四軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即：研究生在校攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬第四軍醫(yī)大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位仍然為第四軍醫(yī)大學(xué)。學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容（含電子版，保密內(nèi)容除外），可以采用影印，縮印或其他復(fù)制手段保存論文。學(xué)校有權(quán)允許論文被查閱和借閱，并在校園網(wǎng)上提供論文內(nèi)容的瀏覽和下載服務(wù)。論文作者簽名：導(dǎo)師簽名：日期：1第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文具有成骨誘導(dǎo)活性的新型融合蛋白的實(shí)驗(yàn)研究博士研究生：張

5、大偉導(dǎo)師：胡蘊(yùn)玉教授輔導(dǎo)老師：李立文博士第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科，西安，710032中文摘要骨缺損的治療是骨科基礎(chǔ)研究與臨床治療的重要研究方向。骨組織工程學(xué)的發(fā)展，為骨缺損的治療開辟了一個(gè)新的領(lǐng)域。骨組織工程學(xué)的研究?jī)?nèi)容主要包含種子細(xì)胞、支架材料和生物活性因子三個(gè)要素。生物活性因子在促使細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其分化方面具有重要作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）是一類具有高效成骨誘導(dǎo)活性的蛋白質(zhì)，在骨組織工程的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用中都取得了很好的效果。目前常用的BMPs生產(chǎn)方法有真核表達(dá)和原核表達(dá)兩種。真核表達(dá)產(chǎn)物活性高，然而生產(chǎn)成本甚高，使其產(chǎn)品無

6、法在臨床推廣應(yīng)用。原核表達(dá)產(chǎn)物為無活性的包涵體，須經(jīng)過復(fù)性成為正確折疊的二聚體才具有生物活性，但是復(fù)性工藝較為復(fù)雜，復(fù)性效率較低，活性不夠穩(wěn)定。采用特殊生產(chǎn)工藝后，原核表達(dá)BMPs生物活性有了較大提高，但在此過程中，生產(chǎn)成本迅速提高，而且在臨床應(yīng)用中，BMPs只有達(dá)到一定量后方能發(fā)揮成骨作用（毫克級(jí)），明顯增加了病人的負(fù)擔(dān)，不利于在臨床大規(guī)模推廣應(yīng)用。因此尋找和研制具有穩(wěn)定、高效成骨誘導(dǎo)活性，并且廉價(jià)的生物分子作為BMPs的替代物，成為矯形外科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向。LMPs是近年來研究發(fā)現(xiàn)的具有成骨誘導(dǎo)活性的細(xì)胞內(nèi)蛋白，其成骨誘導(dǎo)

7、活性甚至優(yōu)于BMPs。通過對(duì)LMPs三種差異剪接體一級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，LMP1（1-133AA）是成骨誘導(dǎo)活性所必需的序列。本研究將蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用域和LMP1（1-133AA）進(jìn)行融合表達(dá)，利用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用域能將和其融合表達(dá)的蛋白分子轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)的特點(diǎn)，2第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文將LMP1（1-133AA）轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)活性，以期獲得一種新的、具有高效成骨誘導(dǎo)活性的新型融合蛋白。一、LMP1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)根據(jù)LMP1基因序列設(shè)計(jì)、合成引物。采用Trizol法提取MG63成骨肉瘤細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-

8、PCR，獲得LMP1cDNA并克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-N3，獲得pEGFP-N3-LMP1真核表達(dá)載體。將該載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)pEGFP-N3-LMP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293后產(chǎn)生熒光僅存