基于磁性微球的固定化金屬親和載體及其在蛋白質(zhì)_多肽純化中的應(yīng)用

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1、第35卷分析化學(xué)(FENXIHUAXUE)研究報告第5期2007年5月ChineseJournalofAnalyticalChemistry628~632基于磁性微球的固定化金屬親和載體及其在蛋白質(zhì)/多肽純化中的應(yīng)用*石若冰張志超陳磊萬謙宏(天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,天津300072)摘要采用模板法制備的單分散磁性硅膠微球,經(jīng)過表面修飾偶聯(lián)上亞氨基二乙酸(IDA),與過渡金屬離2+子Cu螯合,制成一種新型的磁性固定化金屬親和純化載體。用牛血清白蛋白(BSA)作為模型進(jìn)行磁性固定化金屬親和吸附蛋

2、白的研究,結(jié)果表明,BSA在磁性親和載體上的吸附可用Langmuir吸附方程描述,對BSA的飽和吸附量為90mg/g。將磁性親和載體用于帶有組氨酸標(biāo)簽的鎮(zhèn)痛抗腫瘤多肽(analgesic2antitumorpeptide,AGAP)純化,在未經(jīng)過濾的細(xì)胞裂解液中可以將AGAP一步純化,非特異性吸附低,操作簡便,完全適用于含有組氨酸標(biāo)記的重組多肽或蛋白的分離純化。關(guān)鍵詞磁性微球,固定化金屬親和基質(zhì),蛋白質(zhì)純化,重組多肽1引言[1]2+2+2+2+固定化金屬親和純化是利用過渡金屬離子Cu、Ni、Zn

3、和Co等與氨基酸殘基如組氨酸、半胱氨酸和色氨酸等的咪唑基、硫醇基和吲哚基的配位作用,有選擇地分離對金屬離子有親和力的蛋白[2]質(zhì)。分子生物學(xué)的發(fā)展使得從基因水平上設(shè)計重組蛋白的后續(xù)純化成為可能。通過基因工程的方法在重組蛋白的末端加上多聚組氨酸的尾巴,使得其與金屬離子的相互作用大為增強(qiáng),在金屬親和載體上得以保留,與其它不含組氨酸標(biāo)簽的蛋白相分離,從而簡化純化操作。傳統(tǒng)的親和載體多以葡聚糖凝[3]膠(sephadex)和瓊脂糖凝膠(sepharose)為基質(zhì),裝入色譜柱中使用。為了避免對親和載體的污

4、染和堵塞,樣品中不能存在固體顆粒,因此,通常需要對細(xì)胞裂解液進(jìn)行過濾、離心等復(fù)雜的前處理操作,再加上其價格昂貴和機(jī)械強(qiáng)度低,在科研和生產(chǎn)中都存在一定的困難。近年來,集磁性分離的操作簡便性和金屬親和純化的高選擇性于一體的磁性金屬親和分離方法引起了人們的關(guān)注。含有氧化鐵的交聯(lián)瓊[4,5]脂糖凝膠和苯乙烯聚苯乙烯微球是常用的磁化介質(zhì),商品化的磁珠多為此種基質(zhì)。但是這些介質(zhì)價格昂貴。因此,發(fā)展新型磁性微球并尋求其國產(chǎn)化,具有一定的科學(xué)意義和潛在的經(jīng)濟(jì)價值。文獻(xiàn)[6~8]報道了磁響應(yīng)性高、粒徑分布均勻的磁

5、性硅膠微球的制備及其在生物樣品中基因組脫氧核糖核酸(DNA)的提取。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步將磁性硅膠微球應(yīng)用于重組多肽/蛋白的分離純化。與其它磁性親和介質(zhì)相比,具有制備流程簡單、價格低廉、配基與載體反應(yīng)溫和、容易實(shí)現(xiàn)配基功能化等優(yōu)點(diǎn)。用牛血清白蛋白(BSA)作為模型蛋白對其在磁性介質(zhì)上的吸附行為進(jìn)行了研究。此磁性親和純化介質(zhì)具有吸附帶有組氨酸標(biāo)記蛋白的特異性。2實(shí)驗(yàn)部分2.1試劑與儀器亞氨基二乙酸(分析純,湖州生物化學(xué)廠);四乙氧基硅烷(TEOS)、C2縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷,商品名為KH2560(武

6、漢大學(xué)有機(jī)硅有限公司);牛血清白蛋白(BSA,天津厚普生物科技公司);低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(上海生工試劑公司);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。大腸桿菌菌株BL21(DE3)及pET28a2AGAP質(zhì)粒(沈陽藥科大學(xué)惠長野)。UV22450紫外掃描儀(日本島津公司);原子吸收光譜儀(日本日立公司);磁分離架(天津市倍思樂2006209211收稿;2006212208接受本文系國家自然科學(xué)基金資助課題(No.20375027、20575044)*E2mai:lqhwan@tju.edu.cn第5期石若冰等:

7、基于磁性微球的固定化金屬親和載體及其在蛋白質(zhì)/多肽純化中的應(yīng)用629色譜技術(shù)開發(fā)中心);VC130超聲波細(xì)胞破碎儀(美國SONICS);氣浴搖床(國華企業(yè)SHZ282);DYY27TM型電泳儀(北京六一儀器廠);BioDoc2It紫外成像系統(tǒng)(英國UVP公司);電子掃描電鏡(日本日立公司);振動磁強(qiáng)計(美國LDJ公司)。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1硅膠基質(zhì)磁性微球的制備和表征磁性微球的制備參照文獻(xiàn)[6],磁性微球的形貌和磁性特征由磁球的掃描電鏡照片和磁滯回線來說明。2.2.2磁性金屬親和純化介質(zhì)的制

8、備由磁性硅膠微球表面的硅羥基化、環(huán)氧化、亞氨基二乙酸化和螯合金屬離子等4個步驟組成。根據(jù)文獻(xiàn)[9,10]對硅膠基質(zhì)的磁性微球表面功能化修飾,得到表面羧基化的磁球,然后與15%CuSO4溶液室溫混合放置12h,用蒸餾水洗去未結(jié)合的金屬離子后,分散于蛋白吸附緩沖液(20mmol/LPBS,0.5mol/LNaCl,10mmol/L咪唑,pH8.0)中,得到濃度為50g/L的磁性金屬親和載體。2.2.3螯合金屬離子濃度的測定取0.2g磁性微球,與4mL50mmol/LCuSO4溶液充分混合,在搖床中振