家蠶谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶bmgste3基因的克隆與真核表達(dá)

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1、第一章義獻(xiàn)綜述√嚳‘：琴}t’j-衛(wèi)，j“≯一，一‘■圖1．1GSTS的三級(jí)結(jié)構(gòu)‘2m4】Figure1．1TeniaryS仃uctureofGSTsN．末端氨基酸結(jié)構(gòu)域由80個(gè)氨基酸排列形成伊折疊和三股∞螺旋，是GSH的結(jié)合位點(diǎn)(G位點(diǎn))，其中存在一個(gè)相當(dāng)保守的酪氨酸殘基(1b)，該1耐一5的一OH與GSH的硫醇化陰離子形成氫鍵來穩(wěn)定之，因此在催化反應(yīng)中起重要作用(圖1．2)。值得一提的是，(‘，型GsTS存在于幾種哺乳動(dòng)物和秀麗新小桿線蟲中，但與哺乳動(dòng)物其他GSTs不同，其N一末端伸展與C．末端鄰接形成一個(gè)新的結(jié)構(gòu)單位‘51。

2、它們對(duì)經(jīng)典的GSTs底物1一氯．2，4．二硝基苯(1．chloro．2，4．dinitro．enzene，cDNB)的活性非常低，對(duì)谷胱甘肽一瓊脂糖成犁片(glutathione—agarosematrix)無結(jié)合親合力，但能結(jié)合S．乙基谷胱甘肽成型片，并顯示有顯著的谷胱甘肽依賴的硫醇轉(zhuǎn)移酶的活性【16】。圖1．2谷胱甘肽一S．轉(zhuǎn)移酶的N．末端結(jié)構(gòu)域【80】Fig1．2TheN—ter】觸aldomainofGST其余氨基酸以5或6股∞螺旋構(gòu)成C．末端氨基酸結(jié)構(gòu)域。親電子物質(zhì)即底物結(jié)合位點(diǎn)(H位點(diǎn))在不同型GSTs間差別較人，如肛

3、和百型GSTs包含5個(gè)∞螺旋，a型GSTs包含6個(gè)∞螺旋。不同型GSTS在c一末端氨基酸結(jié)構(gòu)域的差異可以解釋a、肌百犁之間的底物特異性差異。不同種類的GSTs氨基酸殘端G位點(diǎn)的功能是不同的，各種GSTS形成的H位點(diǎn)亦不同。不同種屬的同型GSTs的同一結(jié)構(gòu)域也有差異。1．2．2谷胱甘肽．s．轉(zhuǎn)移酶的功能GSTs是一組具有多種生理功能的蛋白質(zhì)，在機(jī)體有毒化合物的代謝過程、保護(hù)細(xì)胞免受急3陰雨人學(xué)壩Ij學(xué)位論義性毒性化學(xué)物質(zhì)攻擊中起到重要作Hj，是體內(nèi)代謝反應(yīng)中II相代謝反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)移酶。其生物學(xué)功能t要是減少GSH的酸解離常數(shù)，使得其

4、具去質(zhì)子化作用及有更多的反應(yīng)性GsTs巰基形成，從而催化其與親電性物質(zhì)軛合【251。通常情況下GSTs催化GSH與親電子物質(zhì)結(jié)合形成硫醇尿酸。經(jīng)腎臟排出體外。亦可作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)親脂化合物，如膽紅素、膽酸、類固醇激素和不同的外源性化合物。通過酶促和非酶促反應(yīng)，解除化學(xué)誘變劑、促癌劑以及脂質(zhì)和DNA氫過氧化物的毒性，保護(hù)正常細(xì)胞免受致癌和促癌因素的影響，在抗誘變及抗腫瘤中起重要作用【261。最后，已知的還有一種質(zhì)粒編碼的細(xì)菌谷胱甘肽．S．轉(zhuǎn)移酶，他和細(xì)菌對(duì)抗生素鱗霉素(1R，2S)．1，2．環(huán)氧丙基磷酸的抗性有關(guān)1271。該酶的特殊

5、之處在于它以很高的特異性將GSH結(jié)合到氯霉素的環(huán)氧乙烷環(huán)上，似乎屬于含金屬原子酶。它的一級(jí)結(jié)構(gòu)與任何可溶性或者微粒體谷胱甘肽．S．轉(zhuǎn)移酶沒有關(guān)系，并且它也不催化GSH與任何用來檢測(cè)可溶性酶的通常電子底物(如CDNB)的偶聯(lián)。1．3昆蟲谷胱甘肽一S．轉(zhuǎn)移酶的研究進(jìn)展谷胱甘肽．S．轉(zhuǎn)移酶(GSTS，EC2．5．1．18)是一類重要的多功能同工酶超家族，廣泛分布在動(dòng)物、植物、酵母和細(xì)菌等生物體中，該酶系在解毒內(nèi)源和外源性有毒物質(zhì)中起著重要作用，同時(shí)也參與胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、激素的合成和細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)【2l。昆蟲谷胱甘肽．S．轉(zhuǎn)移酶的研

6、究主要集中?。畾⑾x荊的解毒代謝和抗氧化的研究中‘72lf73l。13．1昆蟲谷胱甘肽．s．轉(zhuǎn)移酶的分布與誘導(dǎo)谷胱甘肽(GSH)廣泛分布于昆蟲的各種細(xì)胞中。參與細(xì)胞運(yùn)輸、保護(hù)以及許多外源化合物的代謝，反應(yīng)涉及的關(guān)鍵酶是谷胱甘肽．S．轉(zhuǎn)移酶。在哺乳動(dòng)物中，GSTs主要分布在肝臟中。在昆蟲中，脂肪體、消化道、表皮、馬氏管及頭部均有分布【2引。一般而言，抗性品系的GsTs活性高于敏感品系。曾有報(bào)道，家蠅幼蟲GsTs活性隨齡期增加而增加，敏感品系的家蠅成蟲GSTs活性等于或低于幼蟲，抗性品系成蟲GSTs活性高于幼蟲，且60％存在于家蠅腹部，

7、雌性家蠅GSTs活性高于雄性2倍【2¨。埃及伊蚊(Aedes∞gypti)GSTs活性隨幼蟲齡期增加而增加，且幼蟲期活性低于蛹期。以l’2．二氯．4．硝基苯(DIC】舳I)為底物時(shí)，脂肪體GSTs活性占總活性的94％，以1．氯．2，4．二硝基苯(cD_NB)為底物時(shí)’月旨肪體GSB活性為整體活性的50％，表皮為25％，中腸和血液分別為15％和lO％。此外，谷胱甘肽一s．轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平也和昆蟲不同的發(fā)育時(shí)期相關(guān)。比如：岡比亞按蚊佃l叩helesganlbi∞)幼蟲和成蟲的DDT抗性受到發(fā)育階段特異性的GSTs所調(diào)節(jié)l姍。而埃及伊蚊(

8、Aed髓∞g刑i)中谷胱甘肽．s．轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量在整個(gè)幼蟲發(fā)育時(shí)期呈上升趨勢(shì)并在蛻變期(m眈唧。吶osiss協(xié)ge)達(dá)到最高，蛻變后5天成蟲表達(dá)螢降低并過渡到一個(gè)平臺(tái)期，33天以后的成蟲處丁衰老階段。另外西方蜜蜂(ApisI鵬Ili矗湘)的谷胱甘肽