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1、家蠶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶BmGSTe2基因的克隆及功能性研究重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文（學(xué)術(shù)學(xué)位）學(xué)生姓名：周磊指導(dǎo)老師：余泉友副教授專(zhuān)業(yè)：生物學(xué)學(xué)科門(mén)類(lèi)：理學(xué)重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院二O一五年四月CloningandfunctionalcharacterizationofaglutathioneS-transferasegenenBmGSTe2inthesilkwormAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheMaster’
2、sDegreeofofScienceByZhouLeiSupervisedbyAss.Prof.YuQuanyouSpecialty:BiologyCollegeofLifeScienceChongqingUniversity,Chongqing,China.April,2015中文摘要摘要谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs,EC2.5.1.18）是一種多功能超家族酶類(lèi)，普遍存在于真核和原核生物體內(nèi)。GSTs的主要功能是催化谷胱甘肽（GSH）與生物異源性物質(zhì)進(jìn)行軛合反應(yīng)，此外，GSTs還參與生物機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)的代謝，其具有的硒非依賴(lài)性
3、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（non-SeGPx）活性，能夠保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。除了具有催化功能之外，GSTs還能夠與一些疏水性物質(zhì)，如藥物、激素及一些代謝產(chǎn)物進(jìn)行直接的螯合作用。根據(jù)氨基酸序列的相似性和免疫關(guān)系等，將昆蟲(chóng)的胞質(zhì)型GSTs分為6個(gè)已知家族，其中Sigma、Theta、Zeta和Omega四個(gè)家族普遍存在于大多數(shù)生物體中，而Delta和Epsilon為昆蟲(chóng)所特異的家族，還有一些未被分類(lèi)的昆蟲(chóng)GSTs被發(fā)現(xiàn)。家蠶（Bombyxmori）由野蠶（Bombyxmandarina）馴化而來(lái)，作為一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，蠶絲已被開(kāi)發(fā)
4、用于多個(gè)領(lǐng)域。同時(shí)，作為鱗翅目昆蟲(chóng)的重要模式生物，家蠶被廣泛用于昆蟲(chóng)的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究。近年來(lái)，家蠶全基因組測(cè)序的完成以及大量功能基因組學(xué)數(shù)據(jù)的公布，家蠶GSTs的全基因組分析鑒定已經(jīng)完成。本文主要對(duì)家蠶GSTsEpsilon家族中的一個(gè)能被殺蟲(chóng)劑誘導(dǎo)的基因BmGSTe2進(jìn)行了克隆并展開(kāi)功能研究，所得主要結(jié)果如下：1.家蠶BmGSTe2基因的克隆和序列分析通過(guò)RT-PCR從家蠶的中腸組織中克隆得到BmGSTE2編碼基因的全長(zhǎng)cDNA，該基因在GenBank中的檢索號(hào)為：DQ355376。BmGSTe2基因的開(kāi)放讀碼框（OR
5、F）全長(zhǎng)為648bp，編碼215個(gè)氨基酸殘基，編碼蛋白的分子量為24.72kDa，等電點(diǎn)為5.98。根據(jù)氨基酸序列相似性，挑選具有代表性的昆蟲(chóng)GSTs，與BmGSTE2蛋白構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。結(jié)果顯示，BmGSTE2與其他昆蟲(chóng)的Epsilon家族成員聚為一類(lèi)，表明BmGSTE2確屬于昆蟲(chóng)特異的Epsilon家族。通過(guò)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，檢測(cè)到BmGSTE2蛋白的三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：二聚體界面多肽結(jié)合位點(diǎn)，C-末端底物結(jié)合位點(diǎn)（H-位點(diǎn)）和N-末端谷胱甘肽結(jié)合位點(diǎn)（G-位點(diǎn)）。2.家蠶BmGSTE2蛋白的異源表達(dá)和酶活性測(cè)定我們構(gòu)建了pET28a
6、-BmGSTe2原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，BmGSTE2蛋白以可溶形式表達(dá)。通過(guò)離子交換色譜和超濾等方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。純化后的BmGSTE2重組蛋白對(duì)GSTs模式底物CDNB的活性為5.24μmol/min/mg，對(duì)枯稀過(guò)氧化氫表現(xiàn)出的non-SeGPx活性為0.10μmol/min/mg。在BmGSTE2的熱穩(wěn)定性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)梯度溫度孵育后的蛋白進(jìn)行活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)BmGSTE2的酶活性在50°C及以下保持相對(duì)穩(wěn)定。I重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文選用兩種有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑（辛硫磷，毒死蜱
7、）和一種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑（甲氰菊酯）對(duì)BmGSTE2重組蛋白的酶活性進(jìn)行抑制性分析，三種抑制劑對(duì)BmGSTE2活性的抑制模式相似，酶活性都是隨著抑制劑濃度的升高而降低。辛硫磷和毒死蜱兩種有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)劑對(duì)BmGSTE2的酶活性抑制中濃度（IC50）分別為0.15mM和0.18mM，相比之下，甲氰菊酯對(duì)BmGSTE2的抑制強(qiáng)度更高，IC50為0.09mM。3.家蠶BmGSTE2蛋白的組織分布利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)了BmGSTE2在蛋白水平的組織分布，通過(guò)對(duì)家蠶四個(gè)重要組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)BmGSTE2只在家蠶19-440品系5齡3天幼
8、蟲(chóng)的中腸組織中有表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)室條件下，分別用辛硫磷（有機(jī)磷類(lèi)）和甲氰菊酯（擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)）兩種殺蟲(chóng)劑對(duì)家蠶（19-440品系）進(jìn)行連續(xù)多代篩選，并用Westernblotting檢測(cè)BmGSTE2在篩選前后家蠶品系中腸組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，BmGSTE2在辛
