豬偽狂犬病病毒pcr檢測方法的優(yōu)化建立及初步應(yīng)用

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1、5黑龍江畜牧獸醫(yī)6科技版2010年4月(上)119豬偽狂犬病病毒PCR檢測方法的優(yōu)化建立及初步應(yīng)用12111曾強(qiáng),陳響坤,顧萬軍,黃良宗,白挨泉(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,廣東佛山528231;2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院圖書館,廣東佛山528231)+中圖分類號:S852.659.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B文章編號:1004-7034(2010)04-0119-03關(guān)鍵詞:豬偽狂犬病病毒;PCR檢測方法;初步應(yīng)用摘要:為了建立敏感性高、特異性高、重復(fù)性好的豬偽狂犬病病原的PCR檢測方法,試驗(yàn)根據(jù)初步建立的豬偽狂

2、犬病病毒(PRV)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)檢測方法,對其PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,并對25個(gè)豬場210份可疑豬偽狂犬病病毒感染的病料進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明:25個(gè)豬場有24個(gè)檢出PR陽性,豬場檢出率為96%;豬偽狂犬病病毒總體感染陽性率達(dá)60.5%(127/210),感染陽性率最高為100%,最低為0。豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病病毒(PRV)引起的產(chǎn)品。豬的傳染性繁殖障礙性疾病。近年來,有人用聚合酶1.2方法鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction

3、,PCR)診斷技術(shù)對1.2.1引物的設(shè)計(jì)用DNASIS分析偽狂犬病病毒采集的豬偽狂犬病病料進(jìn)行檢測,結(jié)果表明該法具有g(shù)D基因保守區(qū)序列的同源性,用引物設(shè)計(jì)軟件Prim-快速、敏感性高等特點(diǎn)。試驗(yàn)優(yōu)化建立了豬偽狂犬病erPremier3.0設(shè)計(jì)引物,引物長度為18~25bp,擴(kuò)病毒的PCR檢測方法,并對臨床可疑豬偽狂犬病病增片段長度為200~700bp。引物序列為PR15c-毒感染的病料進(jìn)行了應(yīng)用檢測,現(xiàn)報(bào)道如下。cacggaggacgagctggggct-3c,PR25c-gtccacgccccgc-1

4、材料與方法cgcttgaagct-3c,擴(kuò)增片段長度理論值為217bp。引1.1材料物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成。1.1.1病毒、細(xì)菌和病料豬偽狂犬病病毒(Bartha1.2.2病毒DNA的抽提取偽狂犬病病毒細(xì)胞培k61)、豬細(xì)小病毒,由原中國人民解放軍軍需大學(xué)病養(yǎng)液100LL或疑似偽狂犬病病毒感染病料(肺臟)毒室惠贈;豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿20mg于勻漿器中,加入500LL病料DNA抽提裂解菌、豬肺炎巴氏桿菌、沙門桿菌,由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院緩沖液后充分研磨,倒入EP管,加1LL蛋白酶

5、K預(yù)防獸醫(yī)研究室提供。病料采自佛山、惠州、東莞、高(20mg/mL),56e水浴4h;98e水浴5min滅活蛋要、陽江、肇慶、四會、深圳、三水、新興、鶴山等地。白酶K,冰浴5min;加入等體積酚-氯仿,旋渦振蕩1.1.2其他試劑TE(pH值為8.0):10mmol/L1min使之充分混勻,靜置10min后12000g離心Tris-Cl(pH值為8.0),1mmol/LEDTA(pH值為10min;取上清液,重復(fù)加酚-氯仿抽提;離心,取上8.0),50@TAE242g,冰醋酸57.1mL,0.5mol/L

6、清液加入等體積異丙醇,旋渦混勻,靜置10min后EDTA(pH值為8.0)100mL,加三蒸水至1000mL。12000g離心10min;棄上清液,加入75%乙醇病料DNA抽提裂解緩沖液:0.01mol/LTris-HCl1mL,7500g離心10min;棄酒精,真空干燥5min,(pH值為8.0),1mmol/LEDTA,100mmol/LNaC,l加入20LL雙蒸水溶解所抽提DNA。0.5%SDS。BlendTaq酶,TOYOBO公司產(chǎn)品;dNTPs1.2.3PCR檢測方法的初步建立反應(yīng)體系:10@

7、(2.5mmol/L)、DL-2000Marker、瓊脂糖,寶生物工BlendTaq酶緩沖液2.5LL,dNTP(2.5mmol/L)程(大連)有限公司產(chǎn)品;PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒,O-2LL,DNA模板2LL,引物(P1、P2等體積混合物,終mega公司產(chǎn)品;無水乙醇、氯仿等,均為國產(chǎn)分析純濃度為0.5Lmol/L)1LL,ExTaq酶(5U/LL)0.25LL,ddH2O17.25LL,總體積25LL。收稿日期:2009-10-08;修回日期:2010-01-06PCR反應(yīng)過程:94e預(yù)變性5min

8、;94e變性基金項(xiàng)目:廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(34060)30s,55e退火30s,72e延伸1min,共30個(gè)循環(huán);作者簡介:曾強(qiáng)(1970-),男,獸醫(yī)師,碩士.最后72e延伸7min。HeilongjiangAnimalScience120andVeterinaryMedicinel420101.2.4PCR反應(yīng)合適條件的確定退火溫度分別為53.2,55.5,58.1,60.8,6.02,63.2e,引物終濃度2+分別為0.2,0.4