糖化血紅蛋白檢驗(yàn)

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1、糖化血紅蛋白檢驗(yàn)張艷影楊靜(哈爾濱市紅十字中心醫(yī)院150010)【中圖分類號】R185【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1672-5085(2010)35-0421-02【關(guān)鍵詞】糖化血紅蛋白血糖檢驗(yàn)(一)離子交換層析法1.原理用偏酸緩沖劑處理Bio-Rex70陽離子交換樹脂，使之帶負(fù)電荷。它與帶正電荷的Hb有親和力。HbA及HbA,均帶正電荷，由于HbAl的兩個β?鏈N■末端正電荷被糖基清除，正電荷較HbA少，兩者對樹脂的附著力不同。用PH6.7磷酸鹽緩沖液可首先將帶正電荷較少、吸附力較弱的HbAl洗脫下來，用分光光度計(jì)測

2、定洗脫液中的HbAl占總Hb的百分?jǐn)?shù)。2.試劑(1)0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液:稱取無水Na2HPO428.396g,溶于蒸憾水中，并加蒸鐳水至1L(即試劑1)。(2)0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液:稱取NaH2PO4?2H2O31.206g,溶于蒸憾水中，并加蒸憾水至1L(即試劑2)。⑶溶血劑：pH4.62,取25ml試劑2,加0.2mlTritonX-100,加蒸偲水至100mlo(4)洗脫劑1(磷酸鹽緩沖液，pH6.7)：取100ml試劑1150ml試劑2于1000ml容量瓶內(nèi)，加蒸倔水至1L。(5)洗脫劑II(磷酸鹽

3、緩沖液pH6.4)：取300ml試劑1及700ml試劑2,加蒸《留水300ml,混勻即成。(6)Bio-Rex70陽離子交換樹脂，200?400目，鈉型，分析純級。3.操作⑴樹脂處理：稱取Bio-Rex70陽離子交換樹脂10g,加O.lmol/LNaOH溶液30ml,攪勻，置室溫30分鐘，期間攪拌2?3次。然后加濃鹽酸數(shù)滴，調(diào)至pH6.7,棄去上清液，用約50ml蒸憎水洗1次，用洗脫劑II洗2次，再用洗脫劑I洗4次即可。(2)裝柱：將上述處理過的樹脂加洗脫劑I,攪勻，用毛細(xì)滴管吸取樹脂，加入塑料微柱內(nèi)，使樹脂床高度達(dá)30?40m

4、m,樹脂床填充應(yīng)均勻，無氣泡、無斷層。⑶溶血液的制備：將EDTA抗凝血或毛細(xì)管血20μl,加于2.0ml生理鹽水中，搖勻并離心，棄去上清液，僅留下紅細(xì)胞，加溶血劑0.3ml,搖勻，置37°C水浴中15分鐘，以除去不穩(wěn)定的HbAI。(4)柱的準(zhǔn)備：將微柱顛倒搖動，使樹脂混懸，然后去掉上下蓋，將柱插入15mm×150mm的大試管中，讓柱內(nèi)緩沖液完全流出。(5)上樣：用微量加樣器取100μl溶血液，加于微柱內(nèi)樹脂床上，待溶血液完全進(jìn)入樹脂床后，將柱移人另一支15mm×150m潔凈的空試管中。⑹層析洗

5、脫：取3.0ml洗脫劑I,緩緩加于樹脂床上，注意勿沖動樹脂，收集流出物，此即為HbAl(測定管)。(4)對照管:取上述溶血液50μl,加蒸憾水7.5ml搖勻,此即為總Hb管。⑻比色：用分光光度計(jì)，波長415nm,比色杯光徑10mm,以蒸鐳水作空測定各管吸光度。(9)微柱的清洗和保存:用過的柱先加洗脫劑II3.0ml,使Hb全部洗下，再用洗脫劑I洗3次，每次3.0ml,最后加洗脫劑I3.0ml,加上下蓋，保存?zhèn)溆谩?.計(jì)算HbAl(%)二測定管A/(對照管A×⑸×100%。2.參考值成人HbAl(%)：

6、均值6.5%；范圍5.0%?8.0%。(二)親和層析法1?原理用于分離糖化與非糖化Hb的親和層析凝膠柱，是交聯(lián)間■氨基苯硼酸的瓊脂糖珠。2.試劑⑴洗滌緩沖劑(washbrffer,WB)：含250mmol/L醋酸錢、50mmol/L氯化鎂、200mg/L疊氮鈉，調(diào)節(jié)至pH8.0,貯于室溫。⑵洗脫緩沖劑(elutionbuffer,EB)：含200mmol/L山梨醇、100mmol/LTris、200mg/L疊氮鈉，調(diào)節(jié)至pH8.5,貯于室溫。(2)0.1mol/L及1mol//L鹽酸溶液。3操作(1)標(biāo)本采集：EDTA或肝素抗凝

7、，靜脈采血，充分混勻后置4°C可保存1周。⑵溶血液的制備：將抗凝全血離心，吸去血漿、白細(xì)胞及血小板層，吸100μl壓積紅細(xì)胞至小試管中，加2ml蒸憾水充分混勻，靜置5分鐘后,重新混勻后離心，上清液應(yīng)清亮。⑶層析柱準(zhǔn)備：層析柱裝0.5ml固相凝膠(glycol-gelB),保存于4°C,防止直射陽光。如凝膠變?yōu)樽霞t色應(yīng)棄去，測定前取出置室溫，拔去頂塞，傾去柱中液體，再除去底帽，將層析柱插入試管中，加2ml洗滌緩沖劑(WB),讓洗滌液自然流出并棄去，當(dāng)液體水面在凝膠面上成盤狀時即停止。(3)非結(jié)合部分(NB)的洗脫：將上述經(jīng)平

8、衡洗滌過的層析柱插入15ml×150mm標(biāo)為“NB”的試管中。加50μl清亮的溶血液至盤狀液面的頂部，讓其流出。加0.5mlWB液，讓其流岀。此步應(yīng)確保樣品完全進(jìn)入凝膠。加5mlWB液，讓其流岀。以上洗脫總體積應(yīng)為5.55ml,混合。(4)結(jié)合