3綠色熒光蛋白gfp研究進(jìn)展

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1、萬(wàn)方數(shù)據(jù)萬(wàn)方數(shù)據(jù)2004年6月綠色熒光蛋白(GFP)研究進(jìn)展71隨著生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，研究者們迫切需要一種能夠在活體中表達(dá)且易于檢測(cè)的報(bào)告基因，現(xiàn)有的報(bào)告基因主要有：分泌型胎盤磷酸酯酶(s秘P)、B一半乳糖苷酶(互丑cz)、8一葡糖苷酸酶(GUS)、螢火蟲(chóng)熒光素酶(LUc)等，但這些基因的檢測(cè)方法并不理想，它們都需要底物和輔助因子，因而在活體中的應(yīng)用受到限制。最近，一種全新的非酶性報(bào)告基因——綠色熒光蛋白(GFP)引起了人們的關(guān)注，該蛋白能夠自身催化形成發(fā)色結(jié)構(gòu)并在藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。作為報(bào)告基因，GFP是目前唯一能在活細(xì)胞中表達(dá)的發(fā)光蛋白；作為熒光標(biāo)記分子，GFP

2、既具有敏感的標(biāo)記檢測(cè)率，又沒(méi)有放射性的危害。最近又發(fā)現(xiàn)G即還是一個(gè)良好的細(xì)胞間信號(hào)傳遞的動(dòng)態(tài)標(biāo)記分子，可以跟蹤觀測(cè)第二信使。近來(lái)關(guān)于GFP方面的研究和綜述越來(lái)越多，但多是針對(duì)某一方面的特點(diǎn)或應(yīng)用，作者將cFP基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。lGFP基礎(chǔ)理論研究進(jìn)展1．1發(fā)展歷史1962年蹦n舢u颶等?首先從多管水母屬(枷ria、ricto．ria)中分離出了cFP；1992年P(guān)rasller等u3克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一級(jí)結(jié)構(gòu)；1994年ch址e等b3首次在大腸桿菌細(xì)胞和線蟲(chóng)中表達(dá)了GFP，開(kāi)創(chuàng)了GFP應(yīng)用研究的先河，之后很快發(fā)現(xiàn)GFP能在多種異源細(xì)胞中表

3、達(dá)，GFP在細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)等領(lǐng)域中迅速掀起了一股熱潮；199r7年10月18—22日在美國(guó)New—J嘲y專門召開(kāi)了一次關(guān)于GFP的國(guó)際會(huì)議。1．2GFP結(jié)構(gòu)、生化特性、發(fā)光機(jī)制、光譜特性1．2．1結(jié)構(gòu)由正常野生型cFP(wtG即)的cDNA序列推出的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)，由238個(gè)氨基酸殘基組成，sD卜PAGE凝膠電泳測(cè)定其分子量為27—30l【D。晶體學(xué)證據(jù)H’表明，GFP中央是一個(gè)B罐(p一鋤)結(jié)構(gòu)。GFP的生色團(tuán)位于“一69的六肽內(nèi)。生色團(tuán)在翻譯后2—4h內(nèi)自動(dòng)催化形成，并且GFP在合成后需經(jīng)過(guò)一定的折疊過(guò)程形成正確的構(gòu)象后才有功能。GFP生色團(tuán)的形成需要Q，使6

4、6位氨基酸殘基的a、8鍵間脫氫，這就意味著GfP在嚴(yán)格厭氧條件下不能形成熒光。1．2．2生化特性GFP在450—490姍藍(lán)光下最穩(wěn)定，在340—390衄或395一‰的范圍內(nèi)，會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象；強(qiáng)還原劑如5n蝴N啦s04或2n蹦f韜q能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?，但一旦重新暴露在空氣或氧氣中，GFP熒光便會(huì)立即恢復(fù)；弱還原劑和中度氧化劑(如生物材料的固定脫水劑戊二酸或甲醛等)對(duì)cFP熒光影響不大，但GFP對(duì)某些封片指甲油特別敏感；在離體狀態(tài)下，G即對(duì)高溫(70℃)、堿性、除垢劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)普通酶(鏈霉蛋白酶hDI塘∞除外)有較強(qiáng)抗性，GFP熒光在pm．O一12．O時(shí)穩(wěn)定，在p

5、Il5．5—7．0時(shí)開(kāi)始受到影響，在高溫(>70℃)、極端pH或胍基氯化物條件下，GFP會(huì)變性，熒光消失，一旦外界條件恢復(fù)正常，熒光將部分恢復(fù)【5】。1．2．3發(fā)光機(jī)制目前對(duì)GFP的熒光發(fā)光機(jī)制還不清楚，M(Hi∞等人曾提出一個(gè)能量傳遞模式圖來(lái)解釋水母的發(fā)光機(jī)制，但并未獲得認(rèn)同。cII砒嘶等怕。對(duì)GFP進(jìn)行了光譜分析，結(jié)合前人工作提出，GFP有兩個(gè)明顯的吸收帶，對(duì)應(yīng)于GFP的兩種不同構(gòu)象的基態(tài)A和B?；鶓B(tài)A對(duì)應(yīng)于395姍的吸收峰，基態(tài)B對(duì)應(yīng)于475姍的吸收峰，基態(tài)A占優(yōu)勢(shì)，基態(tài)B的分子數(shù)量約是基態(tài)A的1，6，兩種基態(tài)間能緩慢地轉(zhuǎn)換，但激發(fā)態(tài)(*)之間的轉(zhuǎn)換很快且發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移，A。

6、快速高效地衰變至另一激發(fā)態(tài)，應(yīng)該存在一個(gè)中間過(guò)度態(tài)I，質(zhì)子轉(zhuǎn)移使A。轉(zhuǎn)變成I。，I’回遷到基態(tài)I時(shí)產(chǎn)生發(fā)射峰504姍的熒光，構(gòu)象改變使I’轉(zhuǎn)變成B。，由B。到B發(fā)射熒光而不發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移。目前，對(duì)于GFP的作用機(jī)理較為認(rèn)同的僅僅是：GFP是生物發(fā)光過(guò)程中的能量受體，并且是最終的發(fā)光體，不同的生物發(fā)光機(jī)制各不相同，不同的突變體發(fā)光機(jī)制也有很大差異。收稿日期：2003—09—25：修回日期：2003一12二15基金項(xiàng)目：生活垃圾及農(nóng)業(yè)廢氣物處理技術(shù)與示范工程項(xiàng)目(2002從601012—02)作者簡(jiǎn)介：汪恒英(1979一)，女，碩士生，專業(yè)方向?yàn)榄h(huán)境工程，ErIl8il：wh∞舀rIg@

7、yah∞．Ⅻ；。通訊聯(lián)系人(AutIl∞h∞Te叩‘xIdeIlce)。1．2．4光譜特性w蚓FP的光譜是所有GFP中最復(fù)雜的，其熒光激發(fā)主峰在395nm，在475砌處有一個(gè)峰高僅為主峰1，3的小峰。溶液中，395咖激發(fā)的熒光發(fā)射峰在508鋤。475砌激發(fā)的在503姍，這類GFP的生色團(tuán)至少由兩種不同的化學(xué)組分組成，即中性酚和陰離子酚。475姍峰隨GFP分子生色團(tuán)的去質(zhì)子化或陰離子生色團(tuán)的增加而增加，395砌則隨著GFP分子生色團(tuán)的質(zhì)子化或中性生色團(tuán)的增加而增加。野生