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《綠色熒光蛋白gfp標(biāo)記方法.ppt》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、纖維素降解菌X-3的GFP標(biāo)記gfp質(zhì)粒的提取試驗(yàn)路線gfp質(zhì)粒+X-3感受態(tài)細(xì)胞X-3感受態(tài)細(xì)胞的制備電擊轉(zhuǎn)化X-3-gfp標(biāo)記菌經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)驗(yàn)證其穩(wěn)定性，同時(shí)檢測(cè)其相關(guān)理化特性（ph，溫度，含氧量，轉(zhuǎn)速等）是否受到影響，確定gfp標(biāo)記的細(xì)菌可以用于進(jìn)一步研究GFP標(biāo)記菌落觀察油鏡觀察本實(shí)驗(yàn)所需的的材料1.LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g，NaCl10g，酵母浸膏5g，蒸餾水1000ml，pH7.02.抗生素壯觀霉素（SpectinomycineSpe）購(gòu)自Sigma公司3.PEB洗滌液：蔗糖93.1g，MgCl20.2g，KH2PO40.953g,H2O1000ml
2、,pH7.43.電轉(zhuǎn)儀：伯樂(lè)MicroPulser電穿孔儀4.立體熒光顯微鏡：（LeicaMZ12）為瑞士萊卡儀器公司產(chǎn)品5.熒光顯微鏡：ECLIPSE80i高級(jí)研究型顯微鏡6.離心機(jī)：EPPENDORF7.凝膠成像儀：BIO-RADUniversalHoodGel-DocUVImagingSystem8.質(zhì)粒DNA：購(gòu)自AxyGEN生產(chǎn)的AxyPrep質(zhì)粒DNA一.gfp質(zhì)粒的提取1.先在卡那培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)菌液，然后提取該菌液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)2.按照AxyGEN生產(chǎn)的AxyPrep質(zhì)粒DNA說(shuō)明書(shū)上的方法進(jìn)行相關(guān)操作3.采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)粒DNA檢測(cè)a.凝
3、膠制備：瓊脂糖（1g）+TAE（100ml）微波加熱至透明倒入制膠板中b.2μl質(zhì)粒+2μl單染料滴在制膠板上，同時(shí)做mark對(duì)照c.140v，30mind.電泳結(jié)束后，用紫外凝膠成像儀和紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，并記錄→二.X-3感受態(tài)細(xì)胞的制備1.從LB固體平板上挑取新鮮的x-3菌株單菌落于50mlLB液體培養(yǎng)基中，30℃，170r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按照1%接種比例接入100mlLB液體培養(yǎng)基中，30℃，170r/min振蕩培養(yǎng)，每1h測(cè)定1次OD6002.收集生長(zhǎng)中期的培養(yǎng)物于冰水浴中放置20min后，用PEB洗滌液沖洗細(xì)胞4次。具體過(guò)程：用50mlP
4、EB洗滌液沖洗離心過(guò)的菌體，輕輕混勻，然后放于離心機(jī)（8000r,5min）離心，重復(fù)四次。這些過(guò)程都需要隨時(shí)放在冰盒上，保持冷卻。三.電擊轉(zhuǎn)化及熒光觀察1.用250μlPEB洗滌液沖洗最后一次離心的菌體，分別分裝到50μl的離心管中2.取50μl感受態(tài)細(xì)胞+1μl質(zhì)粒（梯度分別為1μl，2.5μl，5μl）置于電轉(zhuǎn)杯上，用槍頭輕輕吹吸，冰上冷卻3.電轉(zhuǎn)儀電擊4.立即用LB培養(yǎng)液活化（1ml），轉(zhuǎn)移到離心管中，震蕩培養(yǎng)1h(120r,37℃)5.取轉(zhuǎn)化后的菌液，分別取10，50，100μl菌液涂布于含有100μg/ml壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)6.取
5、相關(guān)切片在熒光顯微鏡下觀察是否標(biāo)記上。9、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。30-七月-2130-七月-21Friday,July30,202110、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。***7/30/20215:43:04AM11、人總是珍惜為得到。30-七月-21**Jul-2130-Jul-2112、人亂于心，不寬余請(qǐng)。***Friday,July30,202113、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來(lái)懲罰自己。30-七月-2130-七月-21**30July202114、抱最大的希望，作最大的努力。30七月2021**30-七月-2115、一個(gè)人炫耀什么，說(shuō)明他內(nèi)心缺少什么
6、。。七月21*30-七月-21*30July202116、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。**7/30/202117、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。***30-七月-21謝謝大家
