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《ezrin在腎癌中表達臨床意義及其對腎癌生物學(xué)性狀影響實驗的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、博士學(xué)位論文Ezrin在腎癌中表達的臨床意義及其對腎癌生物學(xué)性狀影響的實驗研究博士研究生：楊旭凱指導(dǎo)教師：鄭少斌教授摘要背景與目的腎癌是泌尿系最常見的腫瘤之一，在泌尿系腫瘤中位居第二，具有組織多樣性，發(fā)病機制尚不清楚，腎癌惡性程度高，不易早期發(fā)現(xiàn)，確診時約35％的患者已有轉(zhuǎn)移，2年死亡率高達95％，約40％患者術(shù)后轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，3年存活率小于5％．腎癌一旦出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移，即使行根治性淋巴結(jié)清掃，患者生存期也極少超過5年，由于腎癌先天性對放療、化療都不敏感，放療、化療不作為常規(guī)輔助治療。近年來晚期腎癌的
2、生物治療，靶向治療取得了一定的成績，但療效仍很有限，有待進一步提高。隨著診斷手段，外科技術(shù)的日臻完善，腎癌的預(yù)后有一定的改善，但復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移仍是威脅患者生命的主要因素，因此轉(zhuǎn)移性腎癌的防治是目前研究工作的重點，熱點，迫切需要尋找新的治療方案。眾所周知轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤患者死亡的主要原因，大約90％的惡性腫瘤患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移，腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特征性生物學(xué)之一，也是導(dǎo)致腫瘤預(yù)后差的主要原因，其中腫瘤細胞本身的運動能力的增強是導(dǎo)致腫瘤侵襲性生長和遷移的前提，任何參與改變細胞運動能力的分子都可能成為腫瘤轉(zhuǎn)移
3、的關(guān)鍵分子，肌動蛋白表達量及其空間排布是引起細胞運動改變的直接原因，引起肌動蛋白表達、分布、改變涉及細胞內(nèi)外諸多因素，其中膜細胞骨架蛋白--ezrin(埃茲蛋白)為關(guān)鍵分子，ezrin作為ERM(ezrinradixinmoesin)蛋白家族成員，是一種胞膜與細胞骨架的聯(lián)接蛋白，是將胞外信號傳遞到細胞的重要聯(lián)系分子，近年來研究證中文摘要明ezrin參與多種腫瘤細胞的運動轉(zhuǎn)移，在腫瘤發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用，有關(guān)ezrin在腎癌中的研究目前國內(nèi)外尚未見報道。研究目的：1．從蛋白和基因水平觀察
4、人腎癌組織中ezrin的表達及其與腎癌臨床病理特征的關(guān)系；2．構(gòu)建人ezrin基因短發(fā)夾狀小干擾RAN的質(zhì)粒載體，采用RNA干擾技術(shù)沉默人腎癌細胞系786—0細胞中ezrin基因表達，觀察干擾前后786-0細胞生物學(xué)性狀改變，一方面進一步明確ezrin在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用，另一方面探討利用RNA干擾技術(shù)作為腎癌基因治療的策略和方法。材料和方法一膜細胞骨架蛋白-ezrin在人腎癌組織中表達及其臨床意義。1．對80例腎癌組織和40例癌旁正常腎組織行組織芯片制作及免疫組化染色檢測；結(jié)果判斷：ezrin
5、陽性表達在腎癌細胞膜和胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒；半定量分析：組織切片免疫組化染色評估由同一位病理醫(yī)師完成，按染色強度和陽性表達細胞數(shù)，按照參考文的評分標(biāo)準(zhǔn)，對每張切片進行評分，無染色：0分，染色較弱：1分，中等強度：2分，強染色：3分；按每個視野中陽性細胞百分數(shù)評分，未見陽性細胞：0分，陽性細胞1％---24％：1分，陽性細胞25％～49％：2分，陽性細胞50％---74％：3分，陽性細胞超過75％：4分。以上兩種評分相乘為最終分數(shù)，按本評分系統(tǒng)，最高分為12，最低為零。2．根據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腔靜脈
6、瘤栓形成分為：單純腎癌組織(無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，無腔靜脈瘤栓形成)，癌旁正常腎組織，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腎癌組織，伴有腔靜脈瘤栓形成腎癌組織。每組隨機取10例行RT-PCR和Westernblot測定各組ezrinmRNA及ezrin蛋白相對表達量。二．人ezrin基因短發(fā)夾狀RNA質(zhì)粒載體構(gòu)建、制備及篩選。1．短發(fā)夾狀小干擾RNA的模板寡核苷酸鏈的設(shè)計與合成：從genebank中搜索ezrin基因序列(NM_003379．4GI：161702984)應(yīng)用Ambion在線RNAi設(shè)計軟件，設(shè)計2對siRNAS
7、(smallinterferenceRNAs)，確定并合成兩端分別帶有BamHI和HindlII酶切位點shRNAs(shorthairpinRNAs)單鏈，退火復(fù)性合U博士學(xué)位論文成雙鏈，BamttI和HindlII酶切載體pGenesil-1，連接退火復(fù)性產(chǎn)物，酶切后載體內(nèi)含不同ezrin基因特異性序列的寡核苷酸干擾片斷(shRNA-ezrinl，shP礬A-ezrin2)，另設(shè)計通用陰性pGenesil一卜Ⅷ(。2．重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定和測序分析，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌及大量質(zhì)粒提取。3．sh
8、RNA功能鑒定：常規(guī)細胞培養(yǎng)，待人腎癌細胞系786—0細胞達80一100％融合時，進行傳代，傳至第三代時用脂質(zhì)體lipofectamin住2000轉(zhuǎn)染；786—0細胞分別用兩個重組質(zhì)粒，陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，另設(shè)未轉(zhuǎn)染組為空白對照，即分別為：shRNA-ezrinl，shRNA-ezrin2，shRNA—HK，blank組；于轉(zhuǎn)染后24h在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，根據(jù)綠色熒光蛋白(greenfluorescentproteinGFP)表達后發(fā)綠色熒光的特征，在熒光顯微鏡下觀察GF
