骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)鎘致大鼠腎臟損傷的修復(fù)作用研究

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)鎘致大鼠腎臟損傷的修復(fù)作用研究

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1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)鎘致大鼠腎臟損傷的修復(fù)作用研究ResearchontheRepairEffectofBoneMarrowMesenchymalStemCellsonKidneyInjuryofRatsCausedbyCadmium作者姓名:秦永剛專業(yè)名稱:衛(wèi)生毒理學(xué)指導(dǎo)教師:郭麗教授學(xué)位類別:醫(yī)學(xué)碩士答辯日期:2015年5月29日中文摘要骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)鎘致大鼠腎臟損傷的修復(fù)作用研究自20世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)鎘以來(lái),鎘在人們的日常生產(chǎn)生活中出現(xiàn)日趨頻繁。電鍍、采礦、冶煉、染料及化工廢水的排放等污染水源及土壤,造成人們食用的農(nóng)作物及魚蝦體內(nèi)

2、鎘含量超標(biāo)。鎘在人體內(nèi)的生物半衰期長(zhǎng)達(dá)10-25年,并且鎘的清除率低,最終造成鎘在人體內(nèi)大量蓄積。腎臟可蓄積鎘吸收量的1/3,是鎘中毒的重要靶器官,腎臟的結(jié)構(gòu)及功能損傷不容忽視。目前對(duì)鎘中毒患者主要以對(duì)癥支持治療為主,但只能使病情緩解,無(wú)法修復(fù)腎臟損傷,臨床上迫切需要一種科學(xué)有效的方法來(lái)治療鎘對(duì)機(jī)體造成的腎臟損傷。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymalstemcell,BMSCs)具有來(lái)源方便、穩(wěn)定、易于體外分離培養(yǎng)、增殖能力強(qiáng)、免疫原性弱、多向分化潛能、移植后向受損部位歸巢并修復(fù)其損傷的特點(diǎn),在組織損傷修復(fù)方面具有良好的

3、發(fā)展?jié)撃芎蛷V闊的應(yīng)用前景,近年來(lái)備受醫(yī)學(xué)研究青睞。已有研究表明:BMSCs對(duì)于缺血再灌注引起的腎臟損傷和燒傷引起的肝臟損傷等有良好的修復(fù)效果,但關(guān)于BMSCs能否修復(fù)鎘染毒所致的腎臟組織損傷國(guó)內(nèi)外還未見詳盡報(bào)道。因此本課題將BMSCs移植進(jìn)鎘染毒所致腎臟損傷的大鼠體內(nèi),觀察其對(duì)鎘染毒所致大鼠腎臟損傷的修復(fù)作用,并初步探討其修復(fù)機(jī)制,希望為臨床治療鎘染毒所致腎臟損傷提供新的思路和一定的理論依據(jù)。目的:探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植后對(duì)鎘致腎損傷的修復(fù)作用,并初步探討其作用機(jī)制。方法:取Wistar大鼠乳鼠骨髓細(xì)胞,采用貼壁培養(yǎng)法純化、擴(kuò)

4、增BMSCs。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs周期及表面標(biāo)志物CD44、CD45和CD90。選用30只成年雄性Wistar大鼠,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組(經(jīng)球后靜脈注入生理鹽7水0.2mL)和細(xì)胞治療組(經(jīng)球后靜脈注入BMSCs0.2mL,1×10個(gè)),每組10-1只。給予0.4mg﹒kg體重的CdCl2溶液染毒,每周5次,連續(xù)染毒5周,制備大鼠鎘致腎臟損傷模型,空白對(duì)照組給予等量生理鹽水。染毒結(jié)束后,將氯甲基I苯甲酰胺(CM-Dil)標(biāo)記的BMSCs經(jīng)球后靜脈移植到細(xì)胞治療組大鼠體內(nèi),空白對(duì)照組及模型組給予同等體積的生理鹽水,移植后

5、每日觀察大鼠一般狀況及體質(zhì)量變化。細(xì)胞移植2周后取大鼠血清檢測(cè)肌酐(CR)、尿素氮(BUN)和β2-微球蛋白(β2-MG)含量;取腎臟組織測(cè)定腎臟組織內(nèi)鎘水平;計(jì)算臟器系數(shù);HE染色進(jìn)行病理組織學(xué)觀察;TUNEL法檢測(cè)腎臟組織細(xì)胞凋亡;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3、Beclin1及LC3B的表達(dá);Westernblot法檢測(cè)腎臟組織內(nèi)Bax、Bcl-2的相對(duì)表達(dá)水平。腎臟組織冰凍切片后,采用激光共聚焦顯微鏡觀察BMSCs在細(xì)胞治療組大鼠腎臟組織內(nèi)的定植情況。結(jié)果:BMSCs貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好,流式細(xì)胞儀檢測(cè)

6、顯示BMSCs陽(yáng)性表達(dá)CD44和CD90,基本不表達(dá)CD45,細(xì)胞大部分處于相對(duì)不活躍的靜止期。細(xì)胞移植2周后,模型組大鼠明顯精神萎靡且少動(dòng),細(xì)胞治療組大鼠精神行為狀態(tài)明顯好于模型組,且細(xì)胞治療組大鼠體質(zhì)量顯著高于模型組(P<0.05)。生化法檢測(cè),細(xì)胞治療組大鼠腎臟功能顯著優(yōu)于模型組(P<0.05)。臟器系數(shù)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組相比,模型組大鼠腎臟臟器系數(shù)顯著降低(P<0.05),與模型組相比,細(xì)胞治療組大鼠腎臟臟器系數(shù)顯著增高(P<0.05)。原子吸收法檢測(cè),空白對(duì)照組大鼠腎臟內(nèi)僅有微量鎘蓄積,模型組大鼠與細(xì)胞治療組大鼠腎臟組

7、織內(nèi)蓄積大量鎘,二者無(wú)明顯差別。病理組織學(xué)觀察顯示,模型組大鼠腎臟腎小管及腎小球存在形態(tài)學(xué)損傷,而細(xì)胞治療組大鼠腎臟病理?yè)p傷明顯輕于模型組。TUNEL法檢測(cè),細(xì)胞治療組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組(P<0.05)。免疫組織化學(xué)法檢測(cè),與空白對(duì)照組相比,模型組大鼠腎臟組織內(nèi)Bax、Caspase-3、Beclin1及LC3B蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05),Bcl-2表達(dá)顯著降低(P<0.05),與模型組相比,細(xì)胞治療組大鼠腎臟組織內(nèi)Bax、Caspase-3、Beclin1及LC3B蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),Bc

8、l-2表達(dá)顯著增加(P<0.05)。Westernblot法檢測(cè),與空白對(duì)照組相比,模型組大鼠腎臟組織內(nèi)Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),Bcl-2相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),而Bcl-2與Bax比值(Bcl-

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