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1、西南大學(xué)博士學(xué)位論文RNAi介導(dǎo)的Lcy基因沉默對(duì)番茄果實(shí)中番茄紅素含量的影響姓名：萬群申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：園藝學(xué)指導(dǎo)教師：張興國(guó);宋明20070401西南大學(xué)博十學(xué)位論文根據(jù)GenBank中公布的番茄Pds啟動(dòng)子序列(U46919)設(shè)計(jì)特異引物，從番茄基因組中分離了長(zhǎng)1790bp的,ads啟動(dòng)子序列．測(cè)序結(jié)果表明所分離的Pds啟動(dòng)子序列和GenBank中公布的一致。通過SalI和毖棚I酶切將全長(zhǎng)Pds啟動(dòng)子插入到pVCT一2020表達(dá)載體中，替換掉該載體中GUS基因的35S啟動(dòng)子，構(gòu)建成攜有Pds-GUS基因表達(dá)盒的植物基因表達(dá)載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的
2、轉(zhuǎn)基因方法將Pds-GUS基因轉(zhuǎn)入番茄中，獲得的轉(zhuǎn)基因番茄的果實(shí)j葉片及根經(jīng)X-Gluc染色5h，70％乙醇脫色后，顯微鏡下觀察照相。結(jié)果表明Pds啟動(dòng)子具有果實(shí)特異性的特點(diǎn)．2．番茄紅素環(huán)化酶(Lcy)基因的DNA片段的克隆，根據(jù)GenBank中公布的番茄紅素13環(huán)化酶基因(Lcy-P)序列0【86452)設(shè)計(jì)特異引物，上游引物P166：cTATGGTGTTTGGGTGGATG，下游引物P167：GTGcTcGATGc從cTC囂CTrCTCTA，通過PcR從番茄基因組中獲得了長(zhǎng)302bp的Lcy片段，測(cè)序結(jié)果表明與GenBank公布的一致。3．果實(shí)特異性
3、RNAi的植物表達(dá)載體的構(gòu)建通過Sa]I酶切，補(bǔ)平，再用Bali酶切后連接，得到Lcy片段反向重復(fù)連接的中間克隆載體p∞一srLcy。將pMD-srLcy經(jīng)脅lI酶切，去磷酸化后與內(nèi)含子連接，構(gòu)建RNAi片段的中間克隆載體pMD-RNAi。pMD-RNAi經(jīng)婦，I和ECll36II切下RNAi片段插入到pVCT2020載體中，構(gòu)建成pvCT—RNAi表達(dá)載體。pMn—Pds經(jīng)SalI和＆胡I切下Pds啟動(dòng)子后，將Pds片段插入到SalI和EcogI酶切的pVCT—RNAi載體中，構(gòu)建成pVCT-PdsRNAi載體。構(gòu)建成的pVCT—PdsRNAi表達(dá)載體經(jīng)
4、酶切鑒定，能獲得正確的目的帶，表明構(gòu)建的載體正確。4．番茄遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的建立番茄種子經(jīng)肥皂水清洗2～3次，70％的乙醇消毒30s后，清水沖洗掉乙醇；然后在超凈臺(tái)上用10％的次氯酸鈉消毒30min，滅菌水漂洗4次后。接種于l／2惦培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2～3天，待番茄種子發(fā)芽后，于25℃，光照強(qiáng)度18001x，16h光／8h暗的光周期條件下培養(yǎng)直到子葉完全展開。切取番茄的子葉和下胚軸，分別接種到惦+1．0mg／L6-BA+0．2mg／LIAA+3％蔗糖+6．5％瓊脂的固體培養(yǎng)基上，比較子葉和下胚軸的芽分化能力，結(jié)果表明子葉的芽分化能力高于下胚軸。將番茄子葉接種
5、到IIs附加不同濃度6一隊(duì)(1～3mg／L)與IAA(O．1～O．3mg／L)及6一BA(1～3mg／L)與NAA(0．1～O．3mg／L)組合的培養(yǎng)基上，篩選適宜芽分化的激素濃度及最佳組合。結(jié)果表明在MS+1．0mg／L6-BA+0．2mg／LI從+3％蔗糖+6．5％瓊脂的培養(yǎng)基上番茄子葉的芽誘導(dǎo)率最高，并且誘導(dǎo)芽所需要的時(shí)間最短，長(zhǎng)出的芽最壯，因此本實(shí)驗(yàn)最終采用MS+1．0mWL6-BA+0．2mg／LIAA+3％蔗糖+6．5％瓊脂組合的培養(yǎng)基來誘導(dǎo)番茄子葉發(fā)芽。設(shè)計(jì)不同濃度的IAA(0．2～0．5mg／L)。觀察不定芽生根的速度、數(shù)量及生根的質(zhì)量，以
6、確定適丁二番茄生根的最佳IAA濃度，結(jié)果顯示幼苗在不同培養(yǎng)基中都能生根，其中以含0．4mg／LIAA的培養(yǎng)基生根最快，一周后即出現(xiàn)大鼉不定根，根系比較壯。II摘要為了測(cè)定外植體對(duì)Kan的敏感性，在篩選的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，加入不同濃度的kan(O、10、20、30，40，50、60、70mg／L)測(cè)定外植體的分化情況，每個(gè)濃度3次重復(fù)，每次重復(fù)20個(gè)外植體，接種觀察不同濃度kan對(duì)番茄子葉分化抑制的效果。結(jié)果表明當(dāng)在濃度為60mg／L的培養(yǎng)基上，有少量愈傷組織形成，以后逐漸白化、死去，不能分化出芽；含40mg／Lkan．的培養(yǎng)基上多數(shù)外植體形成較多的愈傷組織
7、，大部分可分化出綠芽，并且生長(zhǎng)正常；因此本實(shí)驗(yàn)所用番茄材料適宜的篩選壓為kan50mg／L．5．轉(zhuǎn)基因番茄的獲得采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將攜帶pVCT-PdsRNAi表達(dá)載體的新鮮的農(nóng)桿菌菌液用液體Ms培養(yǎng)基重懸后，浸染已經(jīng)在分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)兩天的番茄子葉，將經(jīng)農(nóng)桿菌浸染的外植體接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+1．0mg／L6-BA+0．2mg／LI從+309／L蔗糖+瓊脂6．59／L)上28"C暗培養(yǎng)2d，然后將外植體轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基(MS+1．0mg／L6-隊(duì)+0．2mg／kIAA+30g／L蔗糖+300mg／L羧卞青霉素cb，pH5．8)上培養(yǎng)7天，然后把抑菌培
8、養(yǎng)7d后的外植體轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基(MS+1．omg／L6一臥+0．
