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《基于人工miRNA技術(shù)篩選抗登革病毒和乙型肝炎病毒靶標(biāo)》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、中圖分類號R917UDC6lO碩士學(xué)位論文學(xué)校代碼!Q墨3蘭密級公玨基于人工miRNA技術(shù)篩選抗登革病毒和乙型肝炎病毒靶標(biāo)Screeningoftheanti·-denguevirusandanti—·hepatitisBvirustargetsbasedontheartificialmiRNAbiotechnology作者姓名：謝佩雯學(xué)科專業(yè)：藥學(xué)研宄方向：藥物分析學(xué)學(xué)院(系、所)：．藥學(xué)院指導(dǎo)教師：王升啟副指導(dǎo)教師：王學(xué)軍論文答辯日期也!墨：壘：11答辯委員會主席中南大學(xué)二。一三年五月猢力似原創(chuàng)性聲明
2、本人聲明，所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中南大學(xué)或其他單位的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我共同工作的同志對本研究所作的貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明。作者簽名：日期：迎臣年豆月且日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人了解中南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文并根據(jù)國家或湖南省有關(guān)部門規(guī)定送交學(xué)位論文，允許學(xué)位論文被查閱和借閱；學(xué)校可以公布學(xué)位論文的全
3、部或部分內(nèi)容，可以采用復(fù)印、縮印或其它手段保存學(xué)位論文。同時授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到《中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》，并通過網(wǎng)絡(luò)向社會公眾提供信息服務(wù)。作者簽名：勉監(jiān)導(dǎo)師簽名組日期：蘭生年—甥旦日基于人工miRNA技術(shù)篩選抗登革病毒和乙型肝炎病毒靶標(biāo)摘要：目的：本課題利用人工miRNA(artificialmiRNA，amiRNA)技術(shù)分別從靶向病毒尋找抗登革病毒靶點(diǎn)和靶向宿主篩選抗乙型肝炎病毒宿主靶標(biāo)兩個方面進(jìn)行探索研究。方話：1．病毒靶向篩選抗登革病毒靶點(diǎn)：(1)構(gòu)建人工miRNA表達(dá)載
4、體，慢病毒表達(dá)載體；(2)觀察感染登革病毒細(xì)胞的病變情況；(3)CCK-8法檢測細(xì)胞的生存率；(4)間接免疫熒光法檢測登革病毒包膜E蛋白的表達(dá)；(5)蝕斑試驗檢測細(xì)胞感染上清登革病毒的滴度；(6)半定量RT-PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)登革病毒和干擾素相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。2．宿主靶向篩選抗乙型肝炎病毒宿主靶標(biāo)：(1)構(gòu)建人工miRNA慢病毒表達(dá)載體；(2)ELISA法分別檢測培養(yǎng)上清HBsAg和HBeAg的表達(dá)；(3)熒光定量PCR法檢測培養(yǎng)上清HBVDNA的表達(dá)；(4)嘌呤霉素篩選AFP—amiRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)He
5、pG2細(xì)胞；(5)RT-PCR法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)AFPmRNA的表達(dá)；(6)間接免疫熒光法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞AFP蛋白的表達(dá)；(7)ELISA法定量檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞上清AFP蛋白含量。結(jié)果：1．病毒靶向篩選抗登革病毒靶點(diǎn)：針對登革病毒保守區(qū)設(shè)計amiRNA，根據(jù)細(xì)胞病變情況初篩得到對感染DENV-2的細(xì)胞有保護(hù)作用的6條amiRNA，其中DEN-V-128組細(xì)胞生存率為90％，是DENV組的1．8倍，病毒包膜E蛋白的表達(dá)也大大降低：選用抗病毒效果顯著的DENV-128與其余5條有效amiRNA兩兩串聯(lián)后通過細(xì)胞病變情
6、況觀察、CCK-8檢測、細(xì)胞間接免疫熒光實驗篩選得到效果明顯的串聯(lián)序列DENVl28—1382，其細(xì)胞生存率為98％，是DENV組的1．6倍，病毒包膜E蛋白的表達(dá)降低；進(jìn)一步構(gòu)建并包裝表達(dá)DENV-128、DENVl28．1382的慢病毒載體，通過CCK-8法檢測細(xì)胞存活率、間接免疫熒光法檢測病毒包膜E蛋白的表達(dá)情況、半定量RT-PCR檢測DENVmRNA含量、蝕斑試驗檢測感染上清液的病毒滴度、干擾素反應(yīng)檢測amiRNA是否激活內(nèi)源性干擾素反應(yīng)等實驗驗證了amiRNA對登革病毒復(fù)制的特異性抑制效果。2．宿
7、主靶向篩選抗乙型肝炎病毒宿主靶標(biāo)：針對可能與HBV感染復(fù)制相關(guān)的33個宿主分子設(shè)計amiRNA，采用amiRNA慢病毒表達(dá)載體與HBV表達(dá)載體瞬時共轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞，以細(xì)胞上清HBsAg和I-meAg表達(dá)水平作為評價指標(biāo)篩選得到3個宿主分子(作用效率>30％)；選擇甲胎蛋白基因(AFP)進(jìn)行深入研究，針對AFP設(shè)計5條amiRNA，經(jīng)HBsAg、HBeAg和HBVDNA檢測結(jié)果得到瞬時轉(zhuǎn)染對HBV復(fù)制抑制率較高的AFP．559和AFP．1621兩條amiRNA序列，其中AFP．559對HBsAg表達(dá)
8、抑制率為59％(96h)，對I-／BeAg表達(dá)抑制率為44％(96h)，對HBVDNA抑制率達(dá)40％，AFP一1621對HBsAg表達(dá)抑制率為49％(96h)，對HBeAg表達(dá)抑制率為33％(96h)，對HBVDNA抑制率達(dá)37％；然后通過包裝慢病毒建立了AFP的穩(wěn)定沉默HepG2細(xì)胞，RT-PCR、細(xì)胞間接免疫熒光及AFP蛋白定量實驗顯示AFP的mRNA與蛋白表達(dá)均被顯著抑制，證明穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞構(gòu)建成功。結(jié)論：1．針對登革病毒保守
