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2、本人電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。保密的學(xué)位論文在解密后使用本授權(quán)書。學(xué)位論文作者簽名：社指導(dǎo)教師虢壘重塹塑皇簽名日期：如／；年如弓J日遼寧師范大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要?dú)W洲葡萄(I巧tisviniferaL)作為葡萄屬中最重要的～個(gè)品種，主要用作鮮食和釀酒，每年產(chǎn)量約占世界葡萄總產(chǎn)量的90％以上。但其抗逆性較差，易受環(huán)境變化和病蟲害等逆境脅迫因素影響，故其產(chǎn)量與質(zhì)量難以保證。研究表明，在植物逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，特異性轉(zhuǎn)錄因子與相關(guān)抗逆基因啟動(dòng)子的結(jié)合能夠調(diào)控下游基因表達(dá)的時(shí)間和水平，進(jìn)而提高植物的抗逆性。WR_KY蛋白是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，多數(shù)
3、研究表明該蛋白能夠廣泛參與多種生物與非生物脅迫防御反應(yīng)。因此實(shí)驗(yàn)選取歐洲葡萄中的兩個(gè)W／U【Y基因啟動(dòng)子(Va，WRKY26和陰，WRKY27)進(jìn)行研究，分析兩個(gè)礬，WRKY基因啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控能力，為葡萄逆境脅迫響應(yīng)機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。利用歐洲葡萄全基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)方法，分別選取起始密碼子(ATG)上游約1500bp序列作為擴(kuò)增目標(biāo)。依據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)序列信息設(shè)計(jì)引物，使用PCR擴(kuò)增技術(shù)得到了歐洲葡萄陽，WRKY26、M，WRKY27基因啟動(dòng)子序列，其長(zhǎng)度分別為1108bp、1381bp。使用植物啟動(dòng)子順式作用元件分析數(shù)據(jù)庫(kù)PlantCA_RE，對(duì)已擴(kuò)增獲得
4、的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析，結(jié)果表明VvWRKY26、VvWRKY27基因啟動(dòng)子序列包含多種參與植物發(fā)育、生物與非生物脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件，如激素類響應(yīng)元件，水楊酸響應(yīng)元件、茉莉酸響應(yīng)元件；光敏感響應(yīng)元件；熱敏感響應(yīng)元件；胚乳發(fā)育相關(guān)響應(yīng)元件等。依據(jù)上述啟動(dòng)子順式作用元件分析的結(jié)果，分別對(duì)VvWRKY26和VvWRKY27基因啟動(dòng)子設(shè)計(jì)不同的上游引物，利用5’端缺失方法擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子序列，分別命名為VvW26p一，、VvW26p．2、VvW26p．3、VvW26p．4以及VvW27p．J、VvW27p-2、VvW27p-3。通過酶切的方法，將VvWR
5、KY26和VvWRKY27基因啟動(dòng)子缺失片段分別替換pBI．221表達(dá)載體的35S啟動(dòng)子部分，構(gòu)建新的瞬時(shí)表達(dá)載體。進(jìn)一步采用PEG．Ca2+介導(dǎo)的方法，將重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染至分離的擬南芥原生質(zhì)體中培養(yǎng)。利用瞬時(shí)熒光表達(dá)技術(shù)，對(duì)報(bào)告基因LUC(Luciferasereportergene)的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，分析兩個(gè)VvWRKY啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控能力。結(jié)果表明，歐洲葡萄VvWRKY26、VvWRKY27基因啟動(dòng)子序列具有不同的促進(jìn)和抑制區(qū)域，且每個(gè)區(qū)域均能調(diào)控報(bào)告基因的表達(dá)，此結(jié)果為后續(xù)的順式作用元件分析提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。關(guān)鍵詞：歐洲葡萄；WRKY蛋白；啟動(dòng)子；瞬
6、時(shí)表達(dá)葡萄WRKY26、WRKY27基因啟動(dòng)子克隆及功能分析CloningandFunctionalAnalysisofHt／svinife，口WRKY26andWRKY27PromotersAbstractEuropeangrape(V／t／svmiferaL)asoneofthemostimportantspeciesofVitis，isusedfortablegrapeandthewine，anditsannualproductionaccountsforabout90％ofthetotalproductionofgrapesintheworld．Bec
7、auseofitspoorstressresistantability，VitisvinifeyaLisvulnerabletotheinjuriesofenvironmentalchangeandinsectpests．Theyieldandqualityaredifficulttobemaintained．Theresearchesshowedthat,intheprocessofplants’stressresponse，thebindingandregulationsofspecifictranscriptionfactorstostressresis
8、tancegenepromotersr
