《腫瘤的分子診斷》PPT課件

《《腫瘤的分子診斷》PPT課件》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。

1、腫瘤的分子診斷器官病理學(xué)組織病理學(xué)細(xì)胞病理學(xué)免疫病理學(xué)分子病理學(xué)應(yīng)用分子診斷技術(shù)，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理學(xué)機(jī)制及生物學(xué)行為能從分子水平上加以認(rèn)識(shí)，其范圍覆蓋分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)。研究較為深入當(dāng)屬癌基因、抑癌基因及其它相關(guān)基因。第一節(jié)腫瘤基因過(guò)表達(dá)及其檢測(cè)一、基因過(guò)表達(dá)的形式癌基因一般為單拷貝基因，有其編碼的蛋白質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一些癌基因在DNA復(fù)制過(guò)程中形成多個(gè)拷貝，形成雙微粒染色體和均染區(qū)，各種基因的擴(kuò)增常產(chǎn)生基因產(chǎn)物過(guò)表達(dá)，表現(xiàn)為RNA和蛋白質(zhì)量的增加。二、基因過(guò)表達(dá)的檢測(cè)（一）表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)免疫組織化學(xué)

2、（immunohistochemistry）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA?）蛋白印跡（Westernblot）流式細(xì)胞儀測(cè)試法（二）基因擴(kuò)增的檢測(cè)基因拷貝數(shù)的增加和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的mRNA的增加分子診斷檢測(cè)方法:原位雜交（insituhybridization,ISH）熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）原位PCR（insitupolymerasechainreaction）Southern雜交（DNA

3、雜交）Northern雜交（RNA雜交）原位雜交（insituhybridization,ISH）將分子雜交與組織化學(xué)相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)，屬固相核酸分子雜交范圍，它用標(biāo)記的DNA或RNA為探針在原位檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)特異的DNA或RNA序列。優(yōu)點(diǎn)：1、具有分子雜交的特異性強(qiáng)、靈敏高特點(diǎn)，同時(shí)又具有組織細(xì)胞化學(xué)染色的可見(jiàn)性；2、即可用新鮮組織，又可用石蠟包埋組織作回顧性研究；3、所需樣本量少，可用活組織細(xì)針穿刺和細(xì)胞涂片；4、應(yīng)用范圍廣泛，可對(duì)特定的基因（如癌基因、病毒基因）DNA、mRNA的表達(dá)進(jìn)行定位、定性和定量。

4、組織細(xì)胞分布和雜交電鏡的亞細(xì)胞定位研究。分類(lèi)：DNA-DNA雜交DNA-RNA雜交RNA-RNA雜交直接法間接法同位素標(biāo)記非同位素標(biāo)記生物素、地高素、熒光素等雙重標(biāo)記原位雜交技術(shù)熒光原位雜交（FISH）將熒光素標(biāo)記克隆的DNA片段與染色體或細(xì)胞間期染色質(zhì)雜交，以測(cè)試該特定的DNA片段是否有缺失或擴(kuò)增。比較基因組雜交（comparativegenomehybridizationCGH）即將熒光素分別標(biāo)記在去除了重復(fù)序列的腫瘤及正常細(xì)胞基因組DNA上，然后分別與正常染色體進(jìn)行原位雜交，對(duì)該二種不同探針與各個(gè)染色體雜

5、交后的信號(hào)進(jìn)行比較，以了解該腫瘤中細(xì)胞在不同染色體上缺失或擴(kuò)增的狀態(tài)。原位PCR（insitupolymerasechainreaction）將PCR擴(kuò)增技術(shù)和原位雜交技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)靶核苷酸序列在染色體上或組織細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位擴(kuò)增使基因拷貝數(shù)放大，再通過(guò)原位雜交方法檢測(cè)，以達(dá)到對(duì)靶核苷酸進(jìn)行定性、定位、定量分析。一種敏感性高、特異性強(qiáng)，能在組織細(xì)胞原位進(jìn)行低拷貝數(shù)基因定性的研究方法。Southern雜交：一種DNA特定序列定位技術(shù)。以組織或細(xì)胞中獲取基因組DNA，用一種或多種限制性?xún)?nèi)切酶酶切，通過(guò)電

6、泳、轉(zhuǎn)印、原位變性固定于一固相支持物，用已標(biāo)記的特異性DNA或RNA的探針與固定有DNA的固相支持膜雜交，經(jīng)過(guò)放射自顯影或化學(xué)發(fā)光自顯影，對(duì)顯影條帶進(jìn)行分析。Northernblot：用于分析細(xì)胞總RNA或含有polyA尾的RNA樣品中特定mRNA分子大小和豐度的分子雜交技術(shù)，可了解被測(cè)靶基因在細(xì)胞內(nèi)有無(wú)過(guò)表達(dá)。注意問(wèn)題：1、提取組織或細(xì)胞中的RNA，不需酶切而直接采用電泳。2、操作過(guò)程要嚴(yán)格控制RNase的污染。3、RNA只與雙鏈DNA樣本中的一條鏈互補(bǔ)，因此雜交時(shí)所需雙鏈DNA探針的量加大；如采用單鏈探針，

7、無(wú)論是DNA抑或RNA探針，或是寡核苷酸探針，均需確定所用探針能與目標(biāo)RNA互補(bǔ)。第二節(jié)基因突變及其檢測(cè)癌基因和抑癌基因突變是腫瘤發(fā)生中出現(xiàn)頻率較高的分子事件，突變的結(jié)果則使癌基因激活或抑癌基因失活，導(dǎo)致細(xì)胞表型發(fā)生變化和腫瘤發(fā)生。基因突變是一復(fù)雜的過(guò)程，不僅在腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到突變基因，對(duì)于某些癌前病變或癌前狀態(tài)的組織細(xì)胞中也存在不同形式和不同程度的基因突變，在同一腫瘤的不同發(fā)展階段，可能會(huì)涉及多種基因不同形式的突變，說(shuō)明腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多步驟的復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。一、基因突變的形式點(diǎn)突變（poi

8、ntmutation）基因缺失(genelosses)基因異位或重排（genetranslocationandrearrangment）（一）點(diǎn)突變（pointmutation）指基因在特異位置發(fā)生一個(gè)核苷酸的改變，使相應(yīng)蛋白質(zhì)的一個(gè)氨基酸改變，繼而改變了蛋白質(zhì)的空間構(gòu)型和生物學(xué)功能。錯(cuò)義突變（missence）無(wú)義突變（nonsence）終止碼突變（stopcodon）移碼突變（fr