《酵母雙雜交系統(tǒng)》PPT課件

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1、第十八章用酵母雙雜交系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用劉新光xgliu64@163.com蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動(dòng)，包括DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。研究蛋白質(zhì)相互作用的常用方法酵母雙雜交（yeasttwohybridization）親和層析免疫共沉淀蛋白質(zhì)交聯(lián)基于GFP的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的研究方法噬菌體顯示系統(tǒng)篩選酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微

2、弱的、瞬間的作用也能通過報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測(cè)得到。第一節(jié)酵母雙雜交系統(tǒng)簡(jiǎn)介它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。該技術(shù)既可用來研究哺乳動(dòng)物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用。一、酵母雙雜交系統(tǒng)的建立和基本原理經(jīng)典文獻(xiàn)出處FieldsS,SongO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.Nature,1989,340(6230):245-246（一）酵母雙雜交系統(tǒng)的建立1989年美國紐約州立大學(xué)的Fields和Song首先描述了酵

3、母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem)。該系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識(shí)。真核生物基因轉(zhuǎn)錄需要反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子含有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNAbindingdomain)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activationdomain)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響,單獨(dú)存在時(shí)沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過共價(jià)或非共價(jià)鍵連接建立起來的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子的功能。Gal4為酵母半乳糖苷酶基因gal1的轉(zhuǎn)錄激活因子，天然的Gal4分子是由一條由881個(gè)

4、氨基酸殘基組成的多肽鏈。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中的DNA-BD由位于N-末端的1～147位多肽構(gòu)成，能識(shí)別位于Gal4基因的上游激活序列(upstreamactivationsequence，UAS)。此外，在其N-端還具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768～881位多肽構(gòu)成。當(dāng)Gal4的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們?cè)诳臻g上充分接近，則能恢復(fù)Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。Fields和Song將兩個(gè)融合蛋白分別構(gòu)建在穿梭質(zhì)粒上，一個(gè)是將Gal4的DNA-BD與酵母蛋白SNF1融合；另一個(gè)是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。其中，SNF1是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激

5、酶，SNF4是它的一個(gè)結(jié)合蛋白，這兩種蛋白是已知可以相互作用的。當(dāng)兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Gal4結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因LacZ的酵母菌株后，通過SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD與Gal4的AD靠近,形成一個(gè)大的復(fù)合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的DNA-BD可識(shí)別位于Gal4效應(yīng)基因的UAS，并可與之結(jié)合；Gal4的AD則可與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中其他成分結(jié)合，激活UAS下游報(bào)告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。酵母轉(zhuǎn)錄因子（Gal4）與BD-fusion---誘餌（bait）與AD-fusion---獵物或靶蛋白（preyortargetprot

6、ein）報(bào)告基因（reportergene）---LacZ（編碼β-半乳糖苷酶）（二）酵母雙雜交系統(tǒng)的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneXDNA-BD酵母雙雜交動(dòng)畫演示（英文）酵母細(xì)胞作為報(bào)道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn):易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報(bào)告基因酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳

7、動(dòng)物的蛋白相互結(jié)合報(bào)道株經(jīng)改造的、含報(bào)告基因的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞?；蚪M中GAL4基因是缺失型的基因組中引入額外的報(bào)告基因LEU、TRP、HIS改造后的酵母細(xì)胞的特點(diǎn)：通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落表達(dá)“誘餌”和“獵物”蛋白；檢驗(yàn)這兩種蛋白表達(dá)后能否激活酵母中的報(bào)告基因。做法：首先構(gòu)建能表達(dá)“誘餌”和“獵物”蛋白的表達(dá)載體。該載體中可加入進(jìn)行營養(yǎng)型篩選的基因。二、酵母雙雜交系統(tǒng)的基本策略三、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)高敏感性。原因：①采用高拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體，使融合蛋白過量表達(dá)；②激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，之后又