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1、用酵母雙雜交系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復合物是細胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動，包括DNA的復制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號轉(zhuǎn)導和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。研究蛋白質(zhì)相互作用的常用方法酵母雙雜交（yeasttwohybridization）親和層析免疫共沉淀蛋白質(zhì)交聯(lián)基于GFP的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的研究方法噬菌體顯示系統(tǒng)篩選酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋
2、白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到。第一節(jié)酵母雙雜交系統(tǒng)簡介它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。該技術(shù)既可用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用。一、酵母雙雜交系統(tǒng)的建立和基本原理經(jīng)典文獻出處FieldsS,SongO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.Nature,1989,340(6230):245-246（一）酵母雙雜交系統(tǒng)的建
3、立1989年美國紐約州立大學的Fields和Song首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem)。該系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。真核生物基因轉(zhuǎn)錄需要反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，真核生長轉(zhuǎn)錄因子含有兩個不同的結(jié)構(gòu)域：轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNAbindingdomain)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activationdomain)這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響,單獨存在時沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過共價或非共價鍵連接建立起來的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個完整的激活
4、特定基因表達的激活因子的功能。Gal4為酵母半乳糖苷酶基因gal1的轉(zhuǎn)錄激活因子，天然的Gal4分子是由一條由881個氨基酸殘基組成的多肽鏈。兩個結(jié)構(gòu)域中的DNA-BD由位于N-末端的1～147位多肽構(gòu)成，能識別位于Gal4基因的上游激活序列(upstreamactivationsequence，UAS)。此外，在其N-端還具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768～881位多肽構(gòu)成。當Gal4的兩個結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們在空間上充分接近，則能恢復Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。Fields和Song將兩個融
5、合蛋白分別構(gòu)建在穿梭質(zhì)粒上，一個是將Gal4的DNA-BD與酵母蛋白SNF1融合；另一個是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。其中，SNF1是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一個結(jié)合蛋白，這兩種蛋白是已知可以相互作用的。當兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Gal4結(jié)合位點的報告基因LacZ的酵母菌株后，通過SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD與Gal4的AD靠近,形成一個大的復合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的DNA-BD可識別位于Gal4效應(yīng)基因的UAS，并可與之結(jié)
6、合；Gal4的AD則可與轉(zhuǎn)錄復合物中其他成分結(jié)合，激活UAS下游報告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。酵母轉(zhuǎn)錄因子（Gal4）與BD-fusion---誘餌（bait）與AD-fusion---獵物或靶蛋白（preyortargetprotein）報告基因（reportergene）---LacZ（編碼β-半乳糖苷酶）（二）酵母雙雜交系統(tǒng)的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)repor
7、tergeneGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneXDNA-BD酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點:易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴增質(zhì)粒具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報告基因酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白相互結(jié)合報道株經(jīng)改造的、含報告基因的重組質(zhì)粒的宿主細胞。基因組中GAL4基因是缺失型的基因組中引入額外的報告基因LEU、TRP、HIS改造后的酵母細胞的特點：通過功能互補和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落表達“誘餌”和“獵物”蛋白；檢驗這兩種蛋白表達后能否激活酵母中的
8、報告基因。做法：首先構(gòu)建能表達“誘餌”和“獵物”蛋白的表達載體。該載體中可加入進行營養(yǎng)型篩選的基因。二、酵母雙雜交系統(tǒng)的基本策略三、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點高敏感性。原因：①采用高拷貝和強啟動子的表達載體，使融合蛋白過量表達；②激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復合物，之后又與啟動子結(jié)合，此三元復合體使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定；③通過mR
