酵母雙雜交系統(tǒng)技術(shù)介紹

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1、酵母雙雜交系統(tǒng)技術(shù)介紹20July2021寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司主要內(nèi)容酵母雙雜交的背景介紹酵母雙雜交的基本原理Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)常見問題分析背景介紹:關(guān)注蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用研究蛋白組時代蛋白質(zhì)功能生物信息學(xué)的發(fā)展背景介紹:為什么要研究蛋白互作？發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用篩選藥物的作用位點(diǎn)研究藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響建立基因組蛋白連鎖圖背景介紹:Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)的功能發(fā)現(xiàn)新的與已知蛋白互作的蛋白鑒定兩個蛋白之間的相互作用確定蛋白相互作用的區(qū)域背景介紹:Clontech分

2、子生物學(xué)工具ClontechMatchmaker?GeneFunctionGeneExpressionGenediscovery背景介紹:MatchmakerGold系統(tǒng)酵母單雜交-蛋白與DNA的相互作用Matchmaker?GoldYeastOne-HybridLibraryScreeningSystem（630491）酵母雙雜交-蛋白與蛋白的相互作用Matchmaker?GoldYeastTwo-HybridSystem（630489）Makeyourown“Mate&Plate?”librarySystem(630490)酵母三雜交—三個蛋白

3、之間的相互作用pBridgeThree-HybridVector（630404）背景介紹:MatchmakerGold系統(tǒng)原理ReporterGene酵母單雜交酵母雙雜交酵母三雜交ReporterGeneReporterGene主要內(nèi)容酵母雙雜交的背景介紹酵母雙雜交的基本原理Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)常見問題分析基本原理:酵母雙雜交參考文獻(xiàn)Nature.1989Jul20;340(6230):245-6.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.FieldsS,SongO.De

4、partmentofMicrobiology,StateUniversityofNewYorkatStonyBrook,StonyBrook11794.63000次引用基本原理:GAL4轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)ADDNA-BDGAL4蛋白具有兩個功能結(jié)構(gòu)域BD結(jié)合結(jié)構(gòu)域AD激活結(jié)構(gòu)域基本原理:GAL4轉(zhuǎn)錄因子的分子機(jī)理在GAL4based雙雜交系統(tǒng)中:正常情況在酵母細(xì)胞內(nèi):PromotergalmetabolicgeneGALUASTranscriptionADBDReporterGeneGAL4AD基本原理:三個啟動子，四個報(bào)告基因獲得陽性克隆子報(bào)告基因表

5、達(dá)AbA抗性篩選Ade營養(yǎng)篩選His營養(yǎng)篩選X-a-gal藍(lán)白篩選M1G1G2降低假陽性！主要內(nèi)容酵母雙雜交的背景介紹酵母雙雜交的基本原理Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)常見問題分析ClontechMM系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)SMART方法與同源重組技術(shù)結(jié)合構(gòu)建文庫，聰明的酵母自己做克隆。AbA抗性篩選的添加，有效抑制背景生長，大大降低假陽性。文庫構(gòu)建于型酵母菌株α型Y187中，方便后續(xù)與a型菌株Y2HGold進(jìn)行mating直接篩選。ClontechMM系統(tǒng):蛋白互作基本流程驗(yàn)證蛋白互作自己構(gòu)建文庫：630490預(yù)制細(xì)菌文庫：638802（傳統(tǒng)型）預(yù)制酵母菌文庫

6、：630480（均一化，通用型）Clontech蛋白互作相關(guān)試劑盒文庫篩選文庫構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)：630489酵母菌轉(zhuǎn)化試劑盒：630439酵母培養(yǎng)基（套裝）：630495插入片段檢測：630497酵母質(zhì)粒提?。?30467體內(nèi)驗(yàn)證：630489630305體外Co-IP驗(yàn)證：630458630459631723631604文庫構(gòu)建:ClontechMM文庫構(gòu)建方法SMART合成cDNA共轉(zhuǎn)化，涂板培養(yǎng)，收集菌液文庫分裝，凍存1mlmatingAAAAAAAAATTTTTTTTCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGCCCAAAAAAAAAT

7、TTTTTTTGGGLD-PCRCCCAAAAAAAATTTTTTTTGGGSMART合成cDNA共轉(zhuǎn)化，涂板培養(yǎng)，收集菌液文庫分裝，凍存1mlmating聰明的酵母自己做克隆SD/Leu-Y187同源重組SMARTcDNA兩小時構(gòu)建文庫文庫構(gòu)建:ClontechMM文庫構(gòu)建方法SMART合成cDNA共轉(zhuǎn)化，涂板培養(yǎng)，收集菌液文庫分裝，凍存1mlmatingSD/Leu-文庫構(gòu)建:ClontechMM文庫構(gòu)建方法文庫構(gòu)建:ClontechMM自制文庫篩選SMART合成cDNA共轉(zhuǎn)化，涂板培養(yǎng)，收集菌液文庫分裝，凍存1mlmatingY187，AD文

8、庫Y2HGold，BD誘餌培養(yǎng)液DDO/X/A混合QDO/X/A文庫篩選:ClontechMM文庫篩選630489Matc