突變型hGM-CSF在畢赤甲醇酵母中的分泌表達(dá)

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1、2002年6月重慶大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)V0I．25No．6第25卷第6期JournalofChongqingUniversity(NaturalScienceEdition)Jun．2002文章編號：1000—582X(2o02)06—0094—04突變型hGM—CSF在畢赤甲醇酵母中的分泌表達(dá)楊紅，歐陽克清，郭芝剛，李新平，陳云高，蔡紹皙(1．重慶大學(xué)生物工程學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，重慶400044；2．四川成都榮高實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，成都610000)摘要：l臨床研究發(fā)現(xiàn)，與大腸桿菌體系生產(chǎn)的hGM—CSF相比，利用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)

2、的hGM—CSF，具有毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。鑒于非糖基化的hGM—CSF生物活性比人體天然產(chǎn)生的糖基化GM—CSF活『生更高，采用PCR定點(diǎn)突變的方法修改hGM—CSF基因中的糖基化位點(diǎn)，進(jìn)而在畢赤酵母(Pichiapastoris)中實(shí)現(xiàn)該突變型基因的高效表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變型基因的表達(dá)產(chǎn)物具有天然hGM—CSF的活性。關(guān)鍵詞：突變型hGM—CSF；畢赤酵母；分泌表達(dá)中圖分類號：Q786文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A人粒細(xì)胞一巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Human變型基因在畢赤酵母中表達(dá)的產(chǎn)物具有天然hGM—Granulocyte—MacmphageCo

3、lonyStimulatingFactor，hGMCSF的活性。—CSF)是由127個(gè)氨基酸組成的造血生長因子。hGMl材料和方法—CSF主要生物學(xué)功能是刺激造血前體細(xì)胞的增殖、分化和增強(qiáng)成熟效應(yīng)細(xì)胞(主要是中性粒細(xì)胞、嗜酸性1．1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞和單核／巨嗜細(xì)胞)。在臨床上主要用于骨髓移1)質(zhì)粒和菌株。質(zhì)粒pPIC9k，pPIC9K—GM，大腸植、癌癥、AIDS、白細(xì)胞減少等病癥的輔助治療-1]。桿菌(E．coli)TOPIOF’菌株，畢赤酵母(Pichiapastoris)但在治療中還存在許多未盡人意之處，如比活性低，治GS115，K

4、MT1菌株，人胎肝cDNA文庫均由胡應(yīng)和博療時(shí)用量大，循環(huán)半衰期短等缺點(diǎn)。臨床實(shí)驗(yàn)表明，酵士惠贈(zèng)。母系統(tǒng)表達(dá)的hGM—CSF與大腸桿菌體系表達(dá)的hGM2)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。大腸桿菌用LB培養(yǎng)基，—CSF相比，具有較小的毒性和副反應(yīng)發(fā)生率¨。J。天在37cc培養(yǎng)。酵母在30cc培養(yǎng)，完全培養(yǎng)基為YPD，然hGM—CSF由于糖基化程度不同，分子量從14．5～選擇培養(yǎng)基為RDB，表達(dá)增殖培養(yǎng)基為BMGY，誘導(dǎo)32KD不等。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，臨床試驗(yàn)表明未糖表達(dá)培養(yǎng)基為BMMY。按照Invitrogen公司操作手冊配基化的hGM—CSF的生物

5、活性更高¨。J。由此，實(shí)驗(yàn)室制。首次利用引物導(dǎo)入點(diǎn)突變的方法，從eDNA文庫中釣3)酶與試劑。TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、購出該基因并突變了其中的2個(gè)O一糖基化位點(diǎn)，即把自上海生工生物公司，一抗購自Sigma公司，其余試劑9一SerlO—Thr變?yōu)?一Alal0一AlaJ。并選擇了畢為國產(chǎn)分析純。引物合成委托胡應(yīng)和博士在美國赤酵母宿主系統(tǒng)作為表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是Hugene公司合成。近年來應(yīng)用較多的一種表達(dá)系統(tǒng)，它具有胞外分泌表1．2實(shí)驗(yàn)方法達(dá)，外源基因多拷貝重復(fù)整合到酵母染色體上，表達(dá)穩(wěn)1)引物的設(shè)計(jì)與合成。參照發(fā)表的

6、人GM—定，產(chǎn)量高，適合高密度發(fā)酵，下游純化相對容易等優(yōu)CSFcDNA序列，合成了2段引物：點(diǎn)J。是一種良好的表達(dá)系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)以野生型hGMprimed5’GCACGT墜GCACCCGCC～CSF基因在畢赤酵母中表達(dá)作對照。結(jié)果表明，突CGCTCGCCCAGCCCCGCCGCG·收稿日期：2002—02—08作者簡介：楊紅(1974一)，女，四川開江人，重慶大學(xué)碩士研究生。主要從事分子生物學(xué)研究。第25卷第6期楊紅等：突變型hGM—CSF在畢赤甲醇酵母中的分泌表達(dá)95primer25’GGGAATICTCATCACTCCTGGAC2．

7、1hGM—CSF表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定TGGC1、C將從低熔點(diǎn)膠中回收的野生型和變異型hGM—在設(shè)計(jì)5’端寡聚核苷酸引物——引物1時(shí)，引入CSF基因用SnalBI和EcoRI雙酶切，同時(shí)質(zhì)粒載體了SnalB酶切位點(diǎn)，并且將第9位AGC(Ser)和第l0位pPIC9K也用SnalBI和EcoRI雙酶切，分別回收后，連ACG(r)的分別變?yōu)镚CC(Ala)GCG(Ala)。在設(shè)計(jì)3’接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOF’。經(jīng)酶切圖譜分析，構(gòu)建成端的寡核苷酸引物——引物2時(shí)，引入了EcoRI酶切功，得到目的基因的轉(zhuǎn)化子。質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定，與設(shè)計(jì)位點(diǎn)和2

8、個(gè)終止密碼子。的序列一致。目的基因的擴(kuò)增見圖1。質(zhì)粒酶切鑒定2)PCR擴(kuò)增。94℃，1min；55℃，1rain；72℃，1圖譜見圖2。表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K—GMM和pPIC9K—GMmin，30cycles。低熔點(diǎn)膠回