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《中國(guó)水仙凝集素在畢赤酵母中分泌表達(dá)的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文北京化工大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。作者簽名：絲蛐碰日期：墟f2：：<：．1：關(guān)于論文使用授權(quán)的說明學(xué)位論文作者完全了解北京化工大學(xué)有關(guān)保留和使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：研究生在校攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬北京化工大學(xué)
2、。學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許學(xué)位論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容，可以允許采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。保密論文注釋：本學(xué)位論文屬于保密范圍，在土年解密后適用本授權(quán)書。非保密論文注釋：本學(xué)位論文不屬于保密范圍，適用本授權(quán)書。作者簽名：盈艘醴導(dǎo)師簽名：五互岔垂日期：型!蘭：!!三北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文學(xué)位論文數(shù)據(jù)集中圖分類號(hào)o,7學(xué)科分類號(hào)
3、黽o．?y論文編號(hào)t∞
4、Dh(2l≥≯密級(jí)學(xué)位授予單位代碼10010學(xué)位授予單位名稱北京化工大學(xué)
5、作者姓名張朋朋學(xué)號(hào)2009001230獲學(xué)位專業(yè)名稱化學(xué)工程與技術(shù)獲學(xué)位專業(yè)代碼OgJ7o；課題來源實(shí)驗(yàn)室自主立題研究方向蛋白表達(dá)論文題目中國(guó)水仙凝集素在畢赤酵母中的表達(dá)研究關(guān)鍵詞重組凝集素，分泌表達(dá)，中國(guó)水仙，甘露糖結(jié)合，畢赤酵母論文答辯日期陽f2．，習(xí)論文類型聾張砑痕學(xué)位論文評(píng)閱及答辯委員會(huì)情況姓名職稱工作單位學(xué)科專長(zhǎng)指導(dǎo)教師王文雅副教授北京化工大學(xué)生物評(píng)閱人1鄭國(guó)鈞教授北京化工大學(xué)制藥評(píng)闋人2李強(qiáng)副教授清華大學(xué)生物化工評(píng)閱人3評(píng)閱人4評(píng)閱人5答辯委員會(huì)主席豫勁蠢聰枝撇2女爭(zhēng)彪鼢答辯委員1鄹國(guó)鈞數(shù)緩t矽未位z艫鉚茲答辯委員2瑙晶裹
6、旌托訛2天≯咎《落答辯委員3醚良別數(shù)姣托未化z1∈》別巍答辯委員4z呼把未億2，天擴(kuò)崆靴乙答辯委員5北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文V北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文中國(guó)水仙凝集素在畢赤酵母中的表達(dá)研究摘要凝集素表現(xiàn)出很多的活性，包括抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)，抗真菌，HIV-I逆轉(zhuǎn)錄酶抑制，和抗蟲的性質(zhì)等，有些還顯示出抗菌和抗線蟲的性質(zhì)，在實(shí)際中有很大的應(yīng)用前景。但是從原材料中提取純化耗時(shí)費(fèi)力，受原材料來源的限制，產(chǎn)量不高。使用大腸桿菌表達(dá)中國(guó)水仙凝集素的結(jié)果表明，重組蛋白較大一部分是以包涵體形式存在的，所以本論文研究了中國(guó)水仙凝集素在巴斯德畢赤酵母中的分泌
7、表達(dá)。本研究首先將中國(guó)水仙凝集素基因克隆到pPIC9K—T載體(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)上，成功構(gòu)建了畢赤酵母GSll5pPIC9K—NTL，但是SDS—PAGE電泳沒有檢測(cè)到明顯的蛋白表達(dá)。通過對(duì)稀有密碼子的檢查，檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)有使用頻率為10—20％的密碼子17個(gè)，使用頻率為10％密碼子18個(gè)，因此利用DNAWorks等軟件合成了偏好于畢赤酵母的新凝集素基因(NTL-opt)。將優(yōu)化后的水仙凝集素基因NTL—opt與pPIC9K—T載體連接，成功構(gòu)建進(jìn)畢赤酵母中，使用MD缺陷型培養(yǎng)基篩選，再使用PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證酵母基因組，結(jié)果顯示6個(gè)轉(zhuǎn)化
8、子中有3個(gè)為陽性，成功得到重組畢赤酵母GSll5(pPIC9K—NTL—opt)。挑取一株單克隆重組畢赤酵母GSll5(pPIC9K—NTL—opt)，使用BMGY／BMMY有機(jī)培養(yǎng)基進(jìn)行表達(dá)，SDS—PAGE和Westernblotting結(jié)果顯示蛋白得到了成功表達(dá)。簡(jiǎn)單對(duì)比了有機(jī)培養(yǎng)基和無機(jī)培養(yǎng)基、，北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文的表達(dá)，蛋白產(chǎn)量并沒有明顯差異，因此選用無機(jī)鹽培養(yǎng)基作為后期上罐發(fā)酵的培養(yǎng)基。使用bandscan等軟件計(jì)算得到目標(biāo)蛋白占總蛋白含量的80％以上。重組凝集素的性質(zhì)研究顯示，與天然凝集素凝集活性4．76相比，重組
9、水仙凝集素凝集活性為4．39，凝集活性相近；使用圓二色譜的方法分別測(cè)定天然和重組凝集素的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示二者二級(jí)結(jié)構(gòu)相似；對(duì)重組凝集素進(jìn)行去糖基化研究，結(jié)果顯示重組蛋白沒有明顯的糖基化作用。以上結(jié)論表明，重組水仙凝集素與天然水仙凝集素性質(zhì)相似。在重組水仙凝集素畢赤酵母菌株構(gòu)建成功及蛋白初步表達(dá)成功的基礎(chǔ)上，使用5L的發(fā)酵罐進(jìn)行了簡(jiǎn)單的發(fā)酵表達(dá)，發(fā)酵的基本條件為pH5．6，溫度28。C，轉(zhuǎn)速600rpm。研究了發(fā)酵過程中菌濃度，甘油濃度，銨離子濃度的變化。菌體在甘油為碳源的條件下生長(zhǎng)迅速，加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后生長(zhǎng)較緩慢，菌濃度在發(fā)酵
10、罐中可以達(dá)到OD?！逓?90。初始甘油濃度為309／L，在20h急速下降，40h時(shí)基本耗盡，也是此時(shí)開始加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。中國(guó)水仙凝集素在此次表達(dá)中達(dá)到了較高的表達(dá)量，發(fā)酵液中的總蛋白含量最高可達(dá)到1000mg／L。關(guān)鍵
