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《雙價(jià)抗蟲基因PtaCrylAc番茄的遺傳轉(zhuǎn)化研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙價(jià)抗蟲基因Pta-CrylAc番茄的遺傳轉(zhuǎn)化研究摘要本研究優(yōu)化了番茄的再生體系和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄轉(zhuǎn)化體系，并構(gòu)建了應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的雙價(jià)抗蟲載體pCAMBIA3300-bt-pta，以番茄品系Micro-Tom為材料進(jìn)行了番茄轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化番茄的分子生物學(xué)鑒定以及遺傳學(xué)分析，并初步進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因番茄的抗蟲鑒定工作，主要結(jié)果如下:1優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)番茄轉(zhuǎn)化的幾個(gè)影響因素:①外植體長度在5。左右有利于愈傷組織的形成;②光照培養(yǎng)比暗培養(yǎng)更有利于愈傷組織的形成;③農(nóng)桿菌侵染時(shí)間為8-10分鐘:④菌液濃度OD6。約為0.15;⑤侵染液pH=5.2
2、;⑥乙酞丁香酮使用濃度為50umol/L;⑦共培養(yǎng)時(shí)間為三天時(shí)獲得了最高的轉(zhuǎn)化效率;⑧選用狡節(jié)青霉素為抑菌劑，濃度為300mg/l;⑨以PPT作為選擇劑時(shí)的濃度為4mg/lo2以pCAMB工A3300為骨架，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了含半夏凝集素和蘇云金芽抱桿菌的雙價(jià)抗蟲載體，并以根癌農(nóng)桿菌LBAIIOO為侵染菌轉(zhuǎn)化番茄。并且，轉(zhuǎn)化后從325個(gè)外植體獲得再生植株24株，再生率為8.5%.3對(duì)轉(zhuǎn)化的24株再生植株中進(jìn)行TPCR檢測(cè),RT-PCR檢測(cè)以及Southernblot檢測(cè)，并且確定陽性植株為15株，轉(zhuǎn)化率為62.5%04對(duì)T工植株進(jìn)行了抗蟲基因眾FZ刁。
3、分離分析，結(jié)果符合孟德爾規(guī)律，陽性和陰性之比為3;1:并且抗蟲基因CryIA‘和抗蟲基因尸藝a共分離。5對(duì)T,植株進(jìn)行了除草劑抗性檢測(cè)，抗除草劑有效成分PPT在20mg/la6對(duì)TI代植株BP-1^BP-7進(jìn)行了小菜蛾幼蟲初步抗性鑒定，抗蟲性程度較為顯著，但不同植株差異較大。關(guān)鍵詞:番茄，CrylAc,Pta，根癌農(nóng)桿菌，遺傳轉(zhuǎn)化，抗蟲ThegenetictransformationofPta-CrylAcintomatovitaAgrobacterium-mediationAbstractAnefficientregenerationsystema
4、ndAgrobacterium-mediatedtransgenicsystemwasestablishedintomato.AplantexpressionvectorpCAMBIA3300-bt-ptaharboringtwoinsecticidalgeneswasconstructedandemployedinAgrobacterium-mediatedtomatotransformation.Themolecularassay,geneticsanalysisandinsect-resistancetestwereperformedsucce
5、ssfullytotarnsformedtomatovarietyMicro-Tom.Themajorresultssummarizedbellow:IAneficientandrapidAgrobacterium-mediatedtransformationprocedurehasbeenestablished:(!)Theexplantin5mm'longwasoptimalforcallusinduction.)Somel2hours'illuminationwassuitableforcallusinduction.(ITheoptimalt
6、imecourseforinoculationwas8-10minutes.(4I)OptimalconcentrationofagrobacteriaforinoculationwasODa,u=0.15⑥Acidicsolutionforinoculation(pH=5.2).⑥ConcentrationofASwas50umol/Lininoculationsolution.⑦Co-cultivationfor3days⑧Some300mg/ICarbencillinasinhibitorofagrobacteria.⑨Concentratio
7、nofPPTwas4m創(chuàng)Ifortheselection.2WeconstructedaplantexpressionvectorpCAMBIA3300-bt-ptaharboringtwoinsecticidalgenesptageneandbtgene,anduseditinAgrobacteriumLBA1100mediatedtomatotransformation.Weharvested24independentregeneratedpiantletsfrom325explants,andregenerativeratiowas8.5%su
8、ccessfully.3PCR,RTPCRandSouthernhybridizationanalysesc
