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《Ni柱親和層析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、鎳瓊脂糖凝膠FF一、簡介金屬螯合親和色譜，又稱固定金屬離子親和色譜，其原理是利用蛋白質(zhì)表面的一些氨基2+2+2+2+3+酸，如組氨酸能與多種過渡金屬離子Cu，Zn，Ni，Co，F(xiàn)e發(fā)生特殊的相互作用，利用這個原理可以把富含這類氨基酸的蛋白質(zhì)吸附，從而達(dá)到分離的目的。由于這個原因，偶聯(lián)這些金屬離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性地分離出這些含有多個組氨酸的蛋白以及對金屬離子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能與固定金屬離子結(jié)合，但這種結(jié)合力要遠(yuǎn)小于組氨酸殘基與金屬離子的結(jié)合力。鎳瓊脂糖凝膠FF具有更高的載量，物理和化學(xué)穩(wěn)定性好，批次重復(fù)性好，使用壽命長。已經(jīng)螯合
2、好鎳離子，使用更方便，由于顆粒粒度均勻，粒徑小，所以分離效果更好，可完全代替進(jìn)口產(chǎn)品。二、填料特征：特點基團(tuán)密度高，載量大，分辨率高，使用方便?；|(zhì)6%的交聯(lián)瓊脂糖凝膠2+配基Ni配基密度50μmol/ml吸附載量≤45mg/ml填料的顆粒大小45-165μm最大流速300cm/hpH范圍3-10，在位清洗時pH范圍可到2-11保存溫度+4~8℃保存液體20%乙醇三、適用范圍分離能被金屬離子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白及帶His標(biāo)簽的重組蛋白。四、應(yīng)用實例實驗名稱：鎳瓊脂糖凝膠FF色譜分離帶His標(biāo)簽的重組蛋白實驗步驟：1、鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱，1.6×20m
3、，柱床體積為10ml2、用緩沖液1平衡2-5個床體積，流速為2ml/min3、將20ml細(xì)胞破碎液(50mMPBS，pH7.4，0.5MNaCl)0.45μm濾膜過濾，上樣，流速為1ml/min4、用緩沖液1再洗2-5個床體積，流速為2ml/min１北京卓冠科技有限公司北京市海淀區(qū)復(fù)興路乙59號巨星大廈409室郵政編碼：100036TEL：89631256FAX：681617815、用分別含10、20、50、100、200、300、400mMmM咪唑的緩沖液3進(jìn)行階段洗脫，流速為2ml/min，收集各階段洗脫峰，用SDS-PAGE檢測融合蛋白的分子量大小和純度6、用純
4、水流洗5個柱床體積，再用20%的乙醇流洗3個柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于+4~8℃環(huán)境中保存7、色譜圖見圖1，SDS-PAGE結(jié)果見圖2。緩沖液組成：緩沖液1：50mMpH7.4的PBS緩沖液。配制：0.5MNaH2PO419ml，0.5MNa2HPO481ml，NaCl29.3g,加適量水溶解后定容到1000ml。緩沖液2：50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5MNaH2PO419ml，0.5MNa2HPO481ml，NaCl29.3g和咪唑34g,加適量水溶解后定容到1000ml。緩沖液3：不同咪唑濃度的緩沖液B配制：
5、咪唑濃度緩沖液1量(ml)緩沖液2量(ml)10mM98220mM96450mM9010100mM8020200mM6040300mM4060400mM2080SDS-PAGE流程：1BCA法測量樣品蛋白濃度2根據(jù)測定樣品的蛋白濃度，算出5-10μg/孔所需的體積。3向1.5mlEP管中加入含5-10μg蛋白的樣品溶液，若體積小于10μl，則加20mMPBSpH7.4補足10μl；若體積大于10μl，則要加入1ml無水乙醇，－20℃下濃縮1h。4取濃縮樣品10000rpm離心15min，除去上清，37℃烘箱10min去除殘余的乙醇。5在樣品加入20mMPBSpH7.4
6、和2×loadingbuffer各10μl，100℃下10min。取出后用冷卻30s，4000rpm離心1s。6點樣，電泳。實驗結(jié)果：（一）使用鎳螯合瓊脂糖凝膠色譜分離His標(biāo)簽重組蛋白使用色譜填料為鎳瓊脂糖凝膠FF，His標(biāo)簽重組蛋白的上樣量為20ml，用分別含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的緩沖液B進(jìn)行洗脫，色譜結(jié)果見圖3，色譜各組分的SDS-PAGE結(jié)果見圖4。２北京卓冠科技有限公司北京市海淀區(qū)復(fù)興路乙59號巨星大廈409室郵政編碼：100036TEL：89631256FAX：68161781穿透洗脫10016550324A280(mA
7、u)00255075100125150175Vol(ml)圖1.鎳瓊脂糖凝膠FF純化帶His標(biāo)簽重組蛋白123456789圖2.SDS-PAGE圖譜1：標(biāo)準(zhǔn)蛋白，2：上樣液，3：穿透，4：20mM咪唑洗脫，5：50mM咪唑洗脫峰，6：100mM咪唑洗脫峰，7：200mM咪唑洗脫峰，8：300mM咪唑洗脫峰，9：400mM咪唑洗脫峰（二）鎳螯合瓊脂糖凝膠色譜分離His標(biāo)簽重組蛋白包涵體條件和前面的方法基本相同，只是緩沖液中加了8M的脲，溶液配方如下表，其純化色譜圖和電泳圖見圖3、4。要注意的是不同的包涵體溶解度不同，也可以用6M鹽酸胍代替8M脲，因為鹽
