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1、第33卷分析化學(xué)(FENXIHUAXUE)研究報(bào)告第1期2005年1月ChineseJournalofAnalyticalChemistry33~36柱前熒光衍生2高效液相色譜法測定尿和血清中的環(huán)境雌激素3毛麗莎孫成均李永新吳德生趙劍虹(四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院,成都610041)摘要建立了同時(shí)測定人尿和血清中環(huán)境雌激素雙酚A、42壬基酚、17α2乙炔基雌二醇及內(nèi)源性雌激素雌三醇、17α2雌二醇和17β2雌二醇的對硝基苯甲酰氯柱前熒光衍生2高效液相色譜測定方法。尿樣經(jīng)酸水解、固相萃取柱濃縮、凈化分離;血清樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白后,用乙醚萃取游離態(tài)雌激素,N2氣流揮干、在無水條件下,雌
2、激素與對硝基苯甲酰氯反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物,用高效液相色譜法定量。檢出限為2.7~8.3μg/L;加標(biāo)回收率尿樣為78.0%~102.5%,血清樣為72.6%~98.6%;方法精密度為1.29%~4.52%。應(yīng)用本法對20份尿樣和10份血清樣進(jìn)行了測定,結(jié)果滿意。關(guān)鍵詞柱前熒光衍生,高效液相色譜法,固相萃取,尿樣,血清,環(huán)境雌激素1引言近年來,關(guān)于外源性化學(xué)物質(zhì)干擾人類和動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng),影響健康和生殖的研究日益增多。這些外源性化學(xué)物質(zhì)中有一類具有雌激素活性,可模擬內(nèi)源性雌激素的生理、生化作用,或具有拮抗雄性激[1]素的效應(yīng),被稱為環(huán)境雌激素(environmentalestrogens
3、)。目前已報(bào)道的主要有人工合成的藥用雌激素、植物性雌激素、真菌性雌激素、農(nóng)藥、工業(yè)化學(xué)物質(zhì)等。另外,有些內(nèi)源性雌激素,如雌二醇、雌三醇等也可通過人類和動(dòng)物的代謝產(chǎn)物排入環(huán)境,對水體生物產(chǎn)生不良影響。環(huán)境雌激素不易降解,可通過水、食物、空氣等介質(zhì)直接或間接進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi),干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能,從而對機(jī)體的生殖發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等產(chǎn)生多方面的影響。所以,測定尿樣和血清中的環(huán)境雌激素水平,可反映人體接觸狀況,為正確評價(jià)人體環(huán)境雌激素暴露水平提供科學(xué)數(shù)據(jù)。環(huán)境雌激素的化學(xué)測定法主要有氣相色[2][3~5][6][7]譜法、高效液相色譜法、氣相色譜2質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜2質(zhì)譜聯(lián)用法
4、等。[8]柱前熒光衍生2高效液相色譜法測定環(huán)境雌激素鮮有報(bào)道。在作者前期工作的基礎(chǔ)上,利用熒光試劑對硝基苯甲酰氯(p2nitrobenzoylchloride)作衍生劑,與上述被測化合物進(jìn)行柱前衍生,然后用高效液相色譜法進(jìn)行分離測定。本法具有衍生反應(yīng)可于室溫下進(jìn)行,反應(yīng)速度快,方法簡便快速,靈敏準(zhǔn)確和操作步驟較簡單等特點(diǎn)。適宜于尿樣和血清樣品中雌激素的測定。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器及試劑HP1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司),附熒光檢測器;Luna5μC18色譜柱:5μm,250mm×4.6mm、保護(hù)柱(美國Phenomenex公司)、ENV218型C18SPE柱、固
5、相萃取裝置(美國Supelco公司)。乙腈(色譜純);甲醇(色譜純);0.10g/L對硝基苯甲酰氯(分析純)乙腈溶液;Milipore超純水(1812MΩ·cm);標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取雙酚A、42壬基酚、17α2乙炔基雌二醇、雌三醇、17α2雌二醇、17β2雌二醇(均為Sigma試劑)各1.00mg,于10mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液,臨用前用甲醇稀釋成10mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液;其它試劑均為市售分析純。2.2色譜條件流動(dòng)相為乙腈2水,梯度洗脫條件為30%乙腈(V/V)0~12min線性增加至70%,12~12.3min從70%變?yōu)?00%。流速1mL/min
6、,熒光檢測,采用波長切換,在0~8.4min,激發(fā)波長282nm,發(fā)射波長315nm,8.4min后激發(fā)波長切換為228nm,發(fā)射波長為316nm。進(jìn)樣量20μL。2003212210收稿;2004205217接受本文系國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(No.30030120)34分析化學(xué)第33卷2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備分別取0.0、10.0、20.0、40.0和100.0μL混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液置于5支2mL刻度離心管中,弱氮?dú)饬鲹]干。各加入0.10mL對硝基苯甲酰氯乙腈溶液,搖勻后于暗處放置30min,再加入0.40mL30%乙腈2水,離心后,取上清液進(jìn)樣。2.4樣品預(yù)處理2.4.1尿樣吸取
7、尿樣0.50mL置于10mL具塞離心管中,依次加入0.05mL濃鹽酸,0.50mL甲醇,于80℃水浴中作用1h后取出,用5mol/LNaOH溶液調(diào)溶液pH至3左右。每次調(diào)pH前,須用對照尿樣估計(jì)所用NaOH溶液量。樣液過ENV218SPE小柱(過柱前,SPE小柱分別用10mL甲醇和5mL水活化)。然后用二氯甲烷5.0mL分兩次洗脫,合并洗脫液,過無水硫酸鈉小柱脫水,氮?dú)鈸]干。然后按2.3節(jié)所述方法進(jìn)行衍生。2.4.2血清吸取血清0.50mL于10mL具塞離心管中,加入2.0mL乙