《基因工程菌的發(fā)酵》PPT課件

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1、第六節(jié)基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失分配不穩(wěn)定性整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸（curing）基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產(chǎn)生機(jī)制受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組DNA分子的降解外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的

2、生長代謝能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動(dòng)降解程序重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分配這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產(chǎn)生機(jī)制受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組DNA分子的降解外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長代謝能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動(dòng)降解程序重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分配這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促

3、進(jìn)重組分子的缺失重排基因工程菌的穩(wěn)定性重組質(zhì)粒的逃逸率當(dāng)含有重組質(zhì)粒的工程菌在非選擇性條件下生長時(shí)，培養(yǎng)系統(tǒng)中一部分細(xì)胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些空載細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比稱為重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率。重組質(zhì)粒逃逸的原因有：高溫培養(yǎng)、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料促使重組質(zhì)粒滲漏受體細(xì)胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配，細(xì)胞所含重組質(zhì)粒拷貝數(shù)的差異隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而加劇影響基因工程菌穩(wěn)定性的因素載體的選擇遺傳特性宿主的選擇外源基因整合到宿主染色體上培養(yǎng)基生長速率發(fā)酵工藝限制性基質(zhì)溫度pH和溶氧外源基因表達(dá)基

4、因工程菌的穩(wěn)定性提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略改進(jìn)載體受體系統(tǒng)以增加質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括：將R1質(zhì)粒上的parB基因引入表達(dá)型載體中其表達(dá)產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細(xì)胞正確設(shè)置載體上的多克隆位點(diǎn)禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)將受體細(xì)胞的致死性基因安裝在載體上同時(shí)構(gòu)建條件致死性的相應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌的ssb基因（DNA單鏈結(jié)合蛋白編碼基因）基因工程菌的穩(wěn)定性培養(yǎng)基一些基因重組菌在復(fù)合培養(yǎng)基中顯示較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性微生物在含有有機(jī)氮源如酵母抽提物、蛋白胨等營養(yǎng)豐富的復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，由于培養(yǎng)基提供了生長必須的氨基酸

5、和其他物質(zhì)，微生物的生長較在基本培養(yǎng)基中快。培養(yǎng)條件對(duì)基因工程菌穩(wěn)定性的影響比生長速率基因重組菌的比生長速率對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性有很大影響。提高比生長速率有助于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。基因重組菌的比生長速率與培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)，如溫度，pH，溶氧，限制性營養(yǎng)物質(zhì)濃度，有害代謝產(chǎn)物濃度等。在一定的溫度和pH下，限制性基質(zhì)濃度往往是決定比生長速率的主要因素。培養(yǎng)條件對(duì)基因工程菌穩(wěn)定性的影響限制性基質(zhì)一般培養(yǎng)基中各成分并不是完全平衡的，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，微生物的生長通常會(huì)受到一種或幾種物質(zhì)的限制。限制性基質(zhì)的種類對(duì)重組菌有不同的影響培養(yǎng)條件對(duì)基因工程菌穩(wěn)定性的影響

6、pH和溶解氧pH和溶氧影響重組酵母菌的穩(wěn)定性。pH和溶氧是影響微生物生長的重要參數(shù)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)基因重組菌時(shí)，通常都需要維持一定的pH和溶氧水平。在基因重組菌的高密度培養(yǎng)時(shí)，為了維持所需的溶氧水平，除了提高攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，往往還要在通入的空氣中補(bǔ)充氧氣，以提高發(fā)酵罐的供氧能力。培養(yǎng)條件對(duì)基因工程菌穩(wěn)定性的影響外源基因的表達(dá)外源基因的表達(dá)會(huì)引起重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定外源基因高效表達(dá)時(shí)，有可能因競(jìng)爭(zhēng)利用物質(zhì)、能量、核糖體等干擾宿主細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)，并造成質(zhì)粒不穩(wěn)定。例如，吲哚丙烯酸（IAA）是trp操縱子阻遏物的部分去阻遏劑，在培養(yǎng)大腸桿菌MV

7、12（pVH5）時(shí)，在培養(yǎng)基中加入不同量的IAA，發(fā)現(xiàn)隨IAA量的增加，pVH5帶有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表達(dá)水平有很大提高，同時(shí)比生長速率下降，培養(yǎng)液中Trp－的比例上升。電泳分析表明60%～70%色氨酸合成能力喪失是由于質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的變化，其余是由于質(zhì)粒丟失造成。培養(yǎng)條件對(duì)基因工程菌穩(wěn)定性的影響提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素藥物和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素加入大量的抗生素會(huì)使生產(chǎn)成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素，只能維持一定時(shí)間添加抗生素選擇壓力對(duì)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定無

8、能為力載體上的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組份培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略分階段控制培養(yǎng)因外源基因表達(dá)造成質(zhì)粒不穩(wěn)定時(shí)，可以考慮將發(fā)酵過程分