基因工程載體第三章

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1、第三章基因工程載體第一節(jié)基因克隆技術概述一、基因克隆技術基因克隆技術包括把來自不同生物的基因同有自主復制能力的載體DNA在體外人工連接，構建成新的重組的DNA，然后送入受體生物中去表達，從而產生遺傳物質和狀態(tài)的轉移和重新組合。二、目的基因的取得1、直接2、反轉錄酶3、化學合成4、基因文庫5、PCR首先利物理方法（如剪切力、超聲波等）或酶化學方法（如限制性內切核酸酶）將生物細胞染色體DNA切割成為基因水平的許多片段，繼而將這些片段與適當的載體結合。將重組DNA轉入受體菌擴增，獲得無性繁殖的基因文庫，再結合篩選方法，從眾多的轉化子菌株中選出含有某一基因的菌株，從中將重組的D

2、NA分離、回收。這種方法也就是應用基因工程技術術分離目的基因，其特點是繞過直接分離基因的難關，在基因組DNA文庫中篩選出目的基因?？梢哉f這是利用“溜散彈射擊”原理去“命中”某個基因。由于目的基因在整個基因組太小，在像當程度上還得靠“碰運氣”，所以人們稱這個方法為“鳥槍法”或“散彈槍”實驗法。面包酵母吲哚甘油磷酸脫氫酶基因的制取，先用EcoRI把面包酵母DNA切成許多片段，使這些片段與λ載體連成重組DNA，可把這些重組DNA導入“吲哚甘油磷酸脫氫酶型組氨酸缺陷型”大腸桿菌，在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)。只有引入了該基因的細菌才能生長。進一步分離這種菌株，可以得到目的基因。三、重組體

3、的構建1、載體要把一個有用的基因通過基因工程手段送進生物細胞中，需要運載工具，攜帶外源基因進入受體細胞的這種工具叫載體（Vector）。（1）質粒（plasmid)（2）噬菌體?的衍生物（3）科斯質粒（cosmid）（4）單鏈DNA噬菌體M13（5）病毒2、載體的性質1）它必須具有能夠在某些宿主細胞中獨立地自我復制和表達的能力。2）載體DNA的分子量應該較小。3）載體上最好應具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記（如抗藥性基因等），以賦予宿主細胞以不同的表型。4）載體應該具有多個限制性內切酶的單一切點；載體上的單一酶切位點最好是位于檢測表型的遺傳標記基因之內，這樣目的基因是否

4、已連接載體就可以通過這一表型的改變與否而得知，利于篩選重組體。3、酶系的選用四、轉化及重組子篩選鑒定1、轉化（transformation)獲得重組DNA以后，必須將它導入宿主細胞中以擴增表達，這個導入宿主細胞的過程稱為轉化（transformation）感受態(tài)（competence)、電擊2、重組子3、重組子的篩選方法（1）載體上的報告基因（reportergene)抗藥性基因、lacZ基因的顯色反應、發(fā)光基因（lux)（2）單菌落擴增（3）菌落雜交第二節(jié)質粒載體（PlasmidVector)一、質粒的概念附加體（整合質粒，intergrativeplasmid)二

5、、質粒的一般生物學特性1、質粒DNA（1）SC構型：共價閉合環(huán)形DNA(closedcircleDNA,ccDNA)（2）OC構型開環(huán)DNA(opencircleDNA,ocDNA)（3）L型線性DNA(linkerDNA,lDNA)質粒名稱質粒來源核苷酸長度（kb）分子量(MD)pTiAch5土壤農桿菌213142ToL假單胞菌11778F大腸桿菌9563RP4假單胞菌5436ColE1大腸桿菌6.364.2pBR322大腸桿菌4.3622.9pBR345大腸桿菌0.70.462、質粒的復制與遺傳根據質粒與宿主菌的相關程度某種質粒在一個細菌細胞內的數目就稱為這種質粒的

6、拷貝數（copynumber）嚴密型質粒（stringentplasmid)松弛型質粒(relaxedplasmid)根據質粒是否帶有轉移基因（tra基因）接合型質粒（傳遞性質粒）非接合型質粒嚴密型質粒（stringentplasmid)嚴密型質粒通常是一些具有自身傳遞能力的大質粒，復制與宿主菌密切相關，宿主菌內只有1-2個質?？截惔嬖冢斔拗骶鞍缀铣赏Ｖ箷r，質粒的DNA復制也就隨之停止松弛型質粒(relaxedplasmid)松弛型質粒通常是分子量較小，不具傳遞能力的質粒，它在宿主菌內通?？珊?0-200個拷貝，而且不受宿主菌蛋白合成的影響，當宿主菌蛋白質合成停止時

7、，例如當宿主菌遇上有抑制蛋白質合成并阻斷細菌染色體復制的氯霉素或壯觀霉素存在時，質粒DNA的復制仍可繼續(xù)進行，甚至可將數十個增至幾千個。接合型質粒又叫傳遞性質粒，接合型質?？梢詮囊粋€細胞自主地轉移到原來不存在這種質粒的另一個細胞中去。接合型質粒的分子比較大，編碼一套控制質粒DNA轉移的基因。這一過程是由接合型質粒上的轉移基因（tragenes）控制的。非接合型質粒，由于分子小，不足以編碼全部轉移體系所需要的基因，因而不能夠自我轉移。所謂質粒的不親和性，有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能夠在同一