第三章 基因工程載體

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1、第三章基因工程載體基因克隆載體要讓一個從甲生物細胞內(nèi)取出來的基因在乙生物體內(nèi)進行表達，首先得將這個基因送到乙生物的細胞內(nèi)去。能將外源基因送入細胞的工具就是運載體?；蚩寺≥d體(DNA克隆載體)：通過不同途徑能將承載的外源DNA片段(基因)帶入受體細胞，并在其中得以維持的DNA分子。載體的功能及特征一、發(fā)展概況1.第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)2.第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標記基因。如pUC系列載體。3.第三階段：進一步完善載體功能以滿足

2、基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。載體的功能運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件載體應具備的條件在克隆載體DNA分子合適的位置有一至多個克隆位點，供外源DNA片段組入克隆載體DNA分子。至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。至少應有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞?？寺≥d體必須是安全的。第一節(jié)質(zhì)?？寺≥d體一、質(zhì)粒的一般生物學特性發(fā)現(xiàn)：細菌，偶見于鏈霉菌和酵母獨立于染色體之外進行復制和遺傳,又依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)來

3、進行復制和轉(zhuǎn)錄。比病毒還簡單的亞細胞結(jié)構(gòu)，一旦離開寄主細胞則無法繁殖。一、質(zhì)粒的一般生物學特性質(zhì)粒是細菌染色體外能夠自主復制的環(huán)形雙鏈的DNA分子在宿主細胞內(nèi)，質(zhì)粒一般以超螺旋共價閉合環(huán)DNA分子（ccc-DNA）的形式存在。在體外理化因子作用下，質(zhì)粒可以成為開環(huán)DNA分子（oc-DNA）或線形DNA分子（l-DNA）。在變性條件下，質(zhì)?？沙蔀閱捂淒NA分子（ss-DNA）。質(zhì)粒DNA分子大小1-100Kb以上。質(zhì)粒DNA的復制質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)進行自主復制復制方向性：純單向性（ColEI）；純雙向性（F質(zhì)粒）；既有單向又有雙向性（R6K）。根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多

4、寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲椭祁愋停簢谰o型復制控制的質(zhì)粒1–數(shù)個拷貝stringentplasmid松弛型復制控制的質(zhì)粒10個拷貝以上stringentplasmid質(zhì)粒的自主復制性：拷貝數(shù)的控制機制–質(zhì)粒DNA復制啟動控制控制復制引物與模板的結(jié)合oriE.coliColE1plasmid復制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’質(zhì)粒的自主復制性：拷貝數(shù)的控制機制–質(zhì)粒DNA復制啟動控制控制復制起始因子與復制起始位點（ori）的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep質(zhì)粒的不親和性有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個

5、寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細胞的增殖構(gòu)成中，其中必然有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容質(zhì)粒遷移革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用如Col、R的其它成員值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過

6、程由bom和mob基因決定攜帶特殊的遺傳標記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質(zhì)合成抗生素、細菌毒素、有機堿這些標記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義質(zhì)粒載體二、構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略1、能在轉(zhuǎn)化的受體細胞中進行有效的復制，并有較多的拷貝。2、含有盡可能多的克隆位點。3、含有供選擇克隆子的標記基因。4、構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體DNA分子盡可能小。5、根據(jù)特殊需要，使構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體中組裝各種“元件”（小DNA片斷），構(gòu)建成不同用途的質(zhì)?？寺≥d體。三、質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建質(zhì)?？寺?/p>

7、載體的設計和構(gòu)建過程的原則選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒（親本質(zhì)粒）。正確獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件。組裝合適的選擇標記基因。選用合適的啟動子。在能達到預期目的的前提下，構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建過程力求簡單。大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體pBR322及其衍生質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建pBR322的構(gòu)建是質(zhì)粒載體構(gòu)建的一個典范。pBR322的親本質(zhì)粒pSF2124，含有Amp抗性基因pMB1，含有松弛型ColE1的復制起點（ori