基因工程-第三章-基因工程的載體

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1、第三章基因工程的載體載體：攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的工具用于基因工程的載體細(xì)菌質(zhì)粒載體噬菌體λ衍生載體Cosmid載體Phagemid載體酵母質(zhì)粒載體真核病毒載體Bacmid載體YAC載體6/15/2021蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新發(fā)展概況1.第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)2.第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。3.第三階段：進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不

2、同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。6/15/2021蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第三章基因工程的載體作為基因工程載體的基本功能1.運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3.為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件6/15/2021蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第三章基因工程的載體作為基因工程載體必須具備的基本條件1.具有對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）2.具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點3.長度盡可能小，以提高其載裝能力4.具有多種單一的酶切位點5.具有合適的選

3、擇性標(biāo)記6/15/2021蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新遺傳標(biāo)記基因1.標(biāo)記基因的作用1）指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞這種指示可以是選擇性的（Apr，Tcr，Kanr），也可以是非選擇性的（如lacZ）2）指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。*這種指示也可以是選擇性的（如TcS），也可以是非選擇性的（如TcS，lacZα,GUS），絕大多數(shù)為后者。**有的遺傳標(biāo)記基因可以完成上述兩項作用。當(dāng)充任第一作用時，最好是選擇性標(biāo)記基因；當(dāng)完成第二作用時，目前多采用非選擇性的—檢測性標(biāo)記基因。有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記

4、基因（lacZ，GUS等）。6/15/2021蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新2.標(biāo)記基因的種類1）抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）a.抗生素抗性基因:Apr，Tcr，Cmr，Kanr，G418r，Hygr，Neorb.重金屬抗性基因:Cur，Znr，Cdrc.代謝抗性基因:TK，抗除草劑基因2）營養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。3）生化標(biāo)記基因其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如lacZ,GUS,CAT4）

5、噬菌斑6/15/2021蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新3.使用標(biāo)記基因注意要點1）標(biāo)記基因與宿主細(xì)胞2）標(biāo)記基因產(chǎn)物的作用機(jī)制:Apr3）標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)與適用范圍:基因啟動子,翻譯起始序列,密碼子偏愛性4）標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)變化對功能的影響:LacZ,GUS4.常用的遺傳標(biāo)記基因1)四環(huán)素抗性基因（Tcr）Tetracycline可結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種399AAs蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。6/15/2021蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新2)氨芐青霉素抗性基因（A

6、pr）Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類的活性。Apr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，催化β—內(nèi)酰胺環(huán)的水解，使氨芐青霉素失活。3)氯霉素抗性基因（Cmr）Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體50S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙?；?，導(dǎo)致乙?；穆让顾夭荒芙Y(jié)合在核糖體上。4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因Kanamycin，Neomycin和G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。來自轉(zhuǎn)座

7、子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。6/15/2021蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補(bǔ)作用。這兩個部分可獨立存在，分別由兩個基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145AAs)。這兩個基因（LacZ和LacZα）均可作為標(biāo)記基因。β—

8、半乳糖苷酶基因的優(yōu)點:a.酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀b.lacZα編碼5'-端可容許很大的變化而不影響酶活性c.lacZα和β鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大6/