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1、ICS07.100.30C53藥黔中華人民共和國國家標準GB/T19915.3-2005豬鏈球菌2型PCR定型檢測技術MethodfordetectionStreptococcussuistype2byPCR2005-09-27發(fā)布2005-11-01實施中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布中國國家標準化管理委員會GB/T19915.3-2005月明舀豬鏈球菌病是鏈球菌屬中豬源鏈球菌引致的豬鏈球菌病的總稱，其病原主要有豬鏈球菌2型和馬鏈球菌獸疫亞種。豬鏈球菌2型可引起豬敗血癥、腦膜炎等。人可通過傷口感染該菌，并導致死
2、亡。為控制和預防該菌引致的豬鏈球菌病，建立快速、特異、敏感的檢測方法是當務之急。本標準是采用公認的細菌學診斷的現(xiàn)代分子生物學技術制定的。本標準的附錄A是規(guī)范性附錄。本標準由農業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出。本標準由全國動物防疫標準化技術委員會歸口。本標準起草單位:南京農業(yè)大學。本標準主要起草人:陸承平、范紅結、姚火春、何孔旺。GB/T19915.3-2005豬鏈球菌2型PCR定型檢測技術范圍本標準規(guī)定了豬鏈球菌2型的PCR的定型方法。本標準適用于由豬鏈球菌2型引致的病死豬分離菌的檢測和定型。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的
3、引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T6682-1992分析實驗室用水規(guī)格和試驗卞法術語和定義下列術語和定義適用于本標準。3.1豬鏈球菌2型Streptococcussuistype2豬鏈球菌是屬于鏈球菌屬的一種細菌，根據(jù)其英膜多糖抗原的差異，可分為1^-34及1/2共35個血清型。豬鏈球菌2型是豬鏈球菌的一個血清型，不僅對豬致病
4、性很強，而且可以感染特定的人群，是一種重要的人畜共患病病原菌。4測定方法4.1方法提要挑取可疑細菌培養(yǎng)物菌落加人PCR反應管中，進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，與標準分子量標記比較，確定擴增產物的大小。4.2試荊和材料除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682-1992的滅菌雙蒸水。4.2.1豬鏈球菌2型定型PCR反應混合物和豬鏈球菌2型定型套式PCR反應混合物。4.2.2TaqDNA聚合酶。4.2.3瓊脂糖:電泳級。4.2.4嗅化乙錠。4.2.5分子量標記:DL-2000,4.2.6TE緩沖液
5、:10mmol/LTris-HCI(pH8.0),lmmol/LEDTA(pH8.0),4.2.710XPCR緩沖液:100mmol/LKC1,160mmol/L(NH,)zSO-20mmol/LMgSO=200mmol/LTris-HCI(pH8.8),10oTritonX-100,1mg/mLBSA.4.2.8電泳緩沖液:242gTris堿，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加蒸餾水至1000mL，使用時10倍稀釋。4.2.9加樣緩沖液:0.25澳酚藍，40%蔗糖。4.2.10莢膜基
6、因PCR引物和英膜基因套式PCR引物。4.2.11陽性對照和陰性對照。GB/T19915.3-20054.3儀器和設備4.3.1離心機。4.3.2DNA熱循環(huán)儀。4.3.3核酸電泳儀。4.3.4pH計。4.3.5移液器:10pL,20pL,100pL,l000pL,4.3.6紫外線透射儀或凝膠成像系統(tǒng)。4.4英膜墓因PCR操作步驟4.4.1PCR擴增用鉑金耳釣取血平板上的可疑單菌落至含有豬鏈球菌2型定型PCR反應混合物的PCR管中，混勻，加人Taq酶(5U/pL)0.5liL,2000r/min離心10s，立即進行PCR擴
7、增，同時設陽性對照和陰性對照。擴增條件為:950C預變性3min;950C20s,550C30s,720C40s,30個循環(huán);72℃延伸7min,VC保存。4.4.2PCR產物回收按SangongPCR產物回收試劑盒說明書進行。4.4.2.1在25pLPCR產物中加人100pL結合緩沖液II(bindingbufferII),混勻。4.4.2.2將混合物轉移到2mL收集管內的UNIQ-10柱中，室溫放置2min,12000g室溫離心1min,4.4.2.3倒掉收集管中廢液，將UNI奮10柱放置同一個收集管中，加人250pL
8、洗液(washsolution),12000g室溫離心1min,4.4.2.4倒掉收集管中廢液，重復步驟4.4.2.3一次。4.4.2.5取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放人同一個收集管中，12000g室溫離心1min,4.4.2.6將UNIQ-10柱放人一根新的1.5mL微
