冷凍切片操作指南

《冷凍切片操作指南》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、超薄切片機操作指南超薄切片為透射電子顯微鏡觀察提供超薄高分子和生物材料樣品的專門技術(shù)。針對高分子和生物材料，由于電子束穿透能力的限制，必須把樣品切成厚度小于100nm，即采用超薄切片機進行切片。一、切片類型材料的超薄切片分為兩大類，一類是常溫超薄切片：主要應(yīng)用于一般的高分子材料；另一類是冷凍超薄切片（Cro-Ultramicrotomy）：主要應(yīng)用于軟材料如軟塑膠和橡膠等，在低于其玻璃轉(zhuǎn)變溫度時進行切片（溫度越低、塊越硬）。二、切片原理采用機械推進式。即刀固定，樣品每上下運動一次時向前推進一小段距離，進行切片。特點：在設(shè)定的切削行程區(qū)間，樣品以可控速度切片。三

2、、衡量超薄切片的質(zhì)量3.1樣品結(jié)構(gòu)保存良好；3.2切片厚度為70nm左右；3.3切片均勻，無污染，表面無褶皺，無刀痕、無震顫及染色沉淀等現(xiàn)象；3.4樣品支持膜耐受電子束轟擊，觀察時無膜的漂移和破裂現(xiàn)象。四、常溫切片的一般操作流程：1、包埋2、修樣3、制刀槽4、裝樣品5、裝刀6、注水7、定位8、設(shè)定參數(shù)，切片9、撈取樣品10、復(fù)位11、關(guān)機4.1包埋包埋的目的：用包埋劑支持整個樣品結(jié)構(gòu)，并形成特定的機械性能,以便于切片。4.1.1一般選用Spurr樹脂環(huán)氧樹脂進行包埋標(biāo)準(zhǔn)硬度的配方（試劑可以按比例增減）性能標(biāo)準(zhǔn)堅固硬偏硬性軟快速聚合慢速聚合成分/gERL-422

3、110.010.010.010.010.010.0DER-7366.04.05.07.06.06.0NSA26.026.026.026.026.026.0第1頁共6頁DMAE0.40.40.40.41.00.2聚合時間8888316*ERL-4221：二氧化乙烯基環(huán)，分子小，粘度低，聚合塊硬度大。*DER－736：聚丙二醇二縮水甘油醚，增韌劑，分子小，有低粘度性質(zhì)，可調(diào)節(jié)包埋塊硬度。*NSA：壬烯基琥珀酸酐，一種特殊硬化劑，應(yīng)避免暴露在潮濕的大氣中，以防環(huán)氧或酐鏈的水解作用。*DMAE：二甲基氨基乙醇(DMAE)，固化加速劑，使樹脂混合物的使用期限延長。調(diào)整D

4、MAE的量，可調(diào)整固化時間?！purr樹脂最終硬度可用DER－736量調(diào)節(jié)；調(diào)整固化時間，可調(diào)整DMAE的量。4.1.2包埋方法：前三種試劑依次稱量，均勻混合后加入加速劑DMAE，再攪拌均勻，保證沒有氣泡。包入樣品，放入烘箱，一般固化7-8h，烘烤溫度為75度。4.1.3注意事項：（1）所有試劑要防潮；（2）配包埋劑時，每加入一種試劑要攪拌均勻；（3）包埋時動作要輕巧，防止產(chǎn)生氣泡。4.2修樣包埋完成后的樣品塊須先經(jīng)過修整，降樣品塊尖端修整長適當(dāng)大小及形狀，并將要觀察的部分露出。習(xí)慣上將樣品塊修成金字塔形（從側(cè)面觀察），頂面修成梯形或長方形，每邊長度大小應(yīng)小

5、于0.5mm（一般0.2~0.3mm），金字塔高度不宜超過0.2mm。將樣品塊修成平頂?shù)慕鹱炙?，是為了讓樣品在切片過程中得到最佳的支持力。高度過大，切片時容易發(fā)生震動，在切片上留下深淺交替的平行條紋，或?qū)е聵悠穳K前端斷裂。較小的樣品塊較容易進行切片，但過小的切片在電子顯微鏡下可觀察到的東西較少。修樣步驟：4.2.1固定樣品：把烘好的環(huán)氧樹脂取出，固定在修樣臺上；4.2.2修樣（1）削去表面的包埋劑，露出樣品；（2）用雙面刀片在樣品的四周削去包埋劑，將樣品塊修成金字塔形（從側(cè)面觀察），頂面修成梯形或長方形頂部保證有樣品。第2頁共6頁修樣詳細(xì)步驟示意圖：4.2.

6、3注意事項：（1）修樣品是最關(guān)鍵的一步，修樣過程中不要破壞樣品；（2）保證修好的頂部有樣品；保證頂部足夠小。（3）樣品頂部不管修成哪種形狀，其頂邊和底邊必須平行，否則不能形成連續(xù)切片帶4.3制刀槽4.3.1制刀切片一般用玻璃刀，也可用鉆石刀。鉆石刀可以切較硬的樣品，但其價格昂貴。一般選用玻璃刀，玻璃刀由5～7mm厚的硬質(zhì)玻璃制成，用專門的制刀機（用RMC公司的GlassKnifeMaker）制刀。適宜的刀刃應(yīng)該是平整光滑，無鋸齒狀波紋。整把刀最適合切片的部分為Z區(qū)，約占1/3；S區(qū)不用于切片；而E區(qū)的使用需視刀口的品質(zhì)而定。4.3.2制刀槽超薄切片只有漂浮在水

7、面上或其他合適的液面上才便于收集、伸展和撈取，為此在刀口背部裝上一個小的水容器，通常稱為“刀槽”。刀槽可用塑料水槽圍成，刀與塑料水槽接觸處要用熔化的石蠟封固接口，以防漏水。4.3.3注意事項（1）三角形刀只有一邊可做刀口。（2）酒精清洗刀槽，不能有污染物；（3）保證水面稍低于刀口，讓樣品沿著這個斜面一片連著一片往下走4.4裝樣品第3頁共6頁把已修好的樣品夾入樣品架內(nèi)，把樣品架裝在樣品臂上。4.5裝刀把刀槽裝在刀座上，固定。把上刀架放到下刀架上，移動上刀架，在刀口離樣品1mm時，固定下刀架。并根據(jù)樣品軟硬程度不同調(diào)節(jié)玻璃刀的傾斜角度，一般為4°。刀座介紹注意事項

8、：裝刀的時候要小心不要讓刀口碰到樣品。