抗嘔吐毒素多克隆抗體制備、純化及鑒定

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1、抗嘔吐毒素多克隆抗體制備、純化及鑒定作者：張銀志，王俊雙，孫秀蘭【摘要】目的：制備嘔吐毒素(DON)的多克隆抗體，并對(duì)抗體效價(jià)、特異性和抑制率進(jìn)行鑒定。方法：采用EDC法合成了嘔吐毒素的完全抗原DONBSA,并通過免疫新西蘭大白兔，得到嘔吐毒素的多克隆抗體。結(jié)果：ELISA檢測出多抗中含有嘔吐毒素的特異性抗體，其效價(jià)最高為12800,其抑制率為50%時(shí),DON的濃度為10mg/L,DON的最低檢測濃度為0.1mg/Lo與結(jié)構(gòu)類似物T2毒素和NIV的交叉率分別為9.1%和4.9%。結(jié)論：嘔吐毒素經(jīng)過衍生化后制備出完全抗原，經(jīng)免疫

2、新西蘭大白兔后得到的多克隆抗體可以完全滿足ELISA檢測的需要。【關(guān)鍵詞】嘔吐毒素；多克隆抗體；鑒定嘔吐毒素(vomitoxin)又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol；DON))[1],化學(xué)名為3a,7a,15—三龕基草鐮胞菌9烯8酮，屬單端胞霉烯族化合物。DON主要由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)和黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum.)產(chǎn)生，廣泛存在于霉變的小麥、大麥、玉米等谷物籽實(shí)中，具有急性毒性、免疫毒性和胚胎毒性等危害[2-4]。目前國內(nèi)關(guān)于DON的檢測方法，主要包括薄層

3、層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC).氣相色譜法(GC)、LCAPCIMS和免疫學(xué)檢測方法。免疫學(xué)檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、實(shí)驗(yàn)操作較簡單等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用真菌毒素檢測。目前國內(nèi)有少數(shù)幾家公司生產(chǎn)用于檢測嘔吐毒素的ELISA試劑盒，但生產(chǎn)中的主要試劑DON的完全抗原和多克隆抗體基本來自于國外，價(jià)格昂貴。我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)室合成了DON免疫抗原和檢測抗原的基礎(chǔ)上，制備了DON多克隆抗體，對(duì)抗體效價(jià)和特異性進(jìn)行檢測，研究結(jié)果為建立嘔吐毒素的免疫檢測方法奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料酶標(biāo)儀、洗板機(jī)和可調(diào)試移液器為Therm

4、oLabsystem公司；冷凍離心機(jī)為Allegra公司；冷凍干燥機(jī)為Labconco公司；微量可調(diào)移液器:Finnpipette公司；96孔和16孔酶標(biāo)板：Corning公司。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、弗氏不完全佐劑(ICFA)、弗氏完全佐劑(CFA)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)均購自于Sigma公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(HRPIgG).1乙基3(3二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC?HC1)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)上海生工生物技術(shù)服務(wù)工程公司；Tween20國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。透析帶(

5、截留分子量14000)為上海華美生物工程有限公。新西蘭長耳白兔(雄性，1.5?2.0kg）購自上海陳行實(shí)驗(yàn)用兔有限公司。1.2方法1.2.1完全抗原的制備（1）分別稱取DCC0.78mg.NHS1.38mg,并分別溶于100uL的DMF中，待用。（2）分別稱取4mgBSA和MBSA溶于200uL,0.01mol/LpH7.4PBS中，冰箱中冷藏待用。將DON衍生物溶于350uL的DMF中，將NHS溶液加入，并在攪拌的同時(shí)緩慢加入DCC溶液,混合物在4工避光反應(yīng)2h,經(jīng)離心提取上清夜，然后在攪拌的同時(shí)緩慢滴加BSA（或MBSA）

6、溶液，4￡下緩慢攪拌反應(yīng)20ho（3）將產(chǎn)物溶液用0.01mol/LpH7.4PBS溶液在4￡下透析72h,每12h換透析液1次，溶液用小瓶分裝,真空冷凍干燥后，在JC保存。制備包被抗原所用的蛋白為OVA,方法與免疫抗原相同［5-8］。1.2.2抗血清的制備選3只健康新西蘭雄性大白兔,取其中1只作為陰性對(duì)照，剩余2只為實(shí)驗(yàn)組。初次免疫時(shí),將DONBSA凍干粉用生理鹽水溶解，用考馬斯亮藍(lán)法測定其中的蛋白質(zhì)含量，配成1g/L的溶液。將上述溶液與等量完全或不完全福氏佐劑用混合攪拌法將其充分乳化好后，于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部皮下多點(diǎn)注射，1ni

7、L/只。初次免疫后的免疫稱為加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫用福氏不完全佐劑乳化，第1次加強(qiáng)免疫于足下注射，以后的加強(qiáng)免疫于肌肉多點(diǎn)注射，每2周加強(qiáng)免疫1次，劑量與初次免疫相同。第2次加強(qiáng)免疫后，每隔2周耳緣靜脈取血測定效價(jià)變化，4次加強(qiáng)免疫后從耳緣靜脈采血，采用間接酶聯(lián)免疫法測定抗血清效價(jià)。待效價(jià)達(dá)到要求后，單獨(dú)用免疫原沖擊免疫1次，7d后采用頸動(dòng)脈取血獲得抗血清，收集于50mL滅菌塑料離心管中,備用。1.2.3純化塑料離心管傾斜，與水平成50°于室溫下靜置4h,待血液凝固后，于41冰箱過夜，血清自然析出。將血清吸出后，3000r/min

8、離心15min,取上清，與前面吸出的血清混在一起，再以4000r/min離心10min,然后加入0.2g/L疊氮鈉和500mL/L甘油，分裝,-20°C保存?zhèn)溆谩?.2.4效價(jià)測定采用飽和硫酸鐵二次沉淀法純化抗體[9]o1:100稀釋DONOVA包被液，100uL/孔，41冰