資源描述：
《抗嘔吐毒素多克隆抗體的制備、純化及鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、抗嘔吐毒素多克隆抗體的制備、純化及鑒定作者：張銀志，王俊雙，孫秀蘭【摘要】耳的：制備嘔吐毒素(DON)的多克隆抗體，并對抗體效價、特異性和抑制率進行鑒定。方法：采用EDC法合成了嘔吐毒素的完全抗原DONBSA,并通過免疫新西蘭大白兔，得到嘔吐毒素的多克隆抗體。結(jié)果：ELTSA檢測出多抗中含有嘔吐毒素的特異性抗體，其效價最高為12800,其抑制率為50%時，DON的濃度為10mg/L,DON的最低檢測濃度為0.1mg/Lo與結(jié)構(gòu)類似物T2毒素和NIV的交叉率分別為9.1%和4.9%。結(jié)論：嘔吐毒素經(jīng)過衍生化后制備出完全抗
2、原，經(jīng)免疫新西蘭大白兔后得到的多克隆抗體可以完全滿足EHSA檢測的需要?！娟P(guān)鍵詞】嘔吐毒索；多克隆抗體；鑒定嘔吐毒素(vomitoxin)又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(dcoxynivalcnol;DON))[1],化學(xué)名為3a,7a,15一三甕基草鐮抱菌9烯8酮，屬單端抱霉烯族化合物。DON主要由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)和黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum?)產(chǎn)生，廣泛存在于霉變的小麥、大麥、玉米等谷物籽實中，具有急性毒性、免疫毒性和胚胎毒性等危害[2-4]。目前國內(nèi)關(guān)于DON的檢測方
3、法，主要包括薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法（GC）、LCAPCIMS和免疫學(xué)檢測方法。免疫學(xué)檢測方法具有特異性強、靈敏度高、實驗操作較簡單等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用真菌毒素檢測。冃前國內(nèi)有少數(shù)幾家公司生產(chǎn)用于檢測嘔吐毒素的ELISA試劑盒，但生產(chǎn)屮的主要試劑DON的完全抗原和多克隆抗體基本來自于國外，價格昂貴。我們在本實驗室合成了DON免疫抗原和檢測抗原的基礎(chǔ)上，制備了DON多克隆抗體，對抗體效價和特異性進行檢測,研究結(jié)果為建立嘔吐毒素的免疫檢測方法奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料酶標儀、洗板機和
4、可調(diào)試移液器為ThermoLabsystem公司；冷凍離心機為Allegra公司；冷凍于燥機為Labconco公司；微量可調(diào)移液器:Finnpipette公司;96孔和16孔酶標板:Corning公司。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）Jiff弗氏不完全佐劑（TCFA）、弗氏完全佐劑（CFA）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋口（OVA）均購自于Sigma.公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（HRPIgG）、1乙基3（3二甲氨丙基）碳二亞胺鹽酸鹽(EDC?HC1)U!甲基聯(lián)苯胺（TMB）上海生工生物技術(shù)服務(wù)工程公司;Twe
5、en20國藥集團化學(xué)試劑有限公司。透析帶（截留分子量14000）為上海華美生物工程有限公。新西蘭長耳白兔（雄性，1?5?2?0kg）購自上海陳行實驗用兔有限公司。1.2.1完全抗原的制備(1)分別稱取DCC0.78mg>NHS1.38mg,并分別溶于100uL的DMF屮，待用。(2)分別稱取4mgBSA和MBSA溶于200uL,0.01mol/LpH7.4PBS中，冰箱中冷藏待用。將DON衍生物溶于350?L的DMF中，將NHS溶液加入，并在攪拌的同時緩慢加入DCC溶液，混合物在4°C避光反應(yīng)2h,經(jīng)離心提取上清夜，然
6、后在攪拌的同時緩慢滴加BSA(或MBSA)溶液，4°C下緩慢攪拌反應(yīng)20ho(3)將產(chǎn)物溶液用0.01mol/LpH7.4PBS溶液在4°C下透析72h,每12h換透析液1次，溶液用小瓶分裝，真空冷凍干燥后，在4°C保存。制備包被抗原所用的蛋口為OVA,方法與免疫抗原相同[5-8]o1.2.2抗血清的制備選3只健康新西蘭雄性大白兔，取其中1只作為陰性對照，剩余2只為實驗組。初次免疫時，將DONBSA凍干粉用生理鹽水溶解，用考馬斯亮藍法測定其中的蛋白質(zhì)含量，配成1g/L的溶液。將上述溶液與等量完全或不完全福氏佐劑用混合攪
7、拌法將其充分乳化好后，于實驗動物背部皮下多點注射，ImL/只。初次免疫后的免疫稱為加強免疫，加強免疫用福氏不完全佐劑乳化，第1次加強免疫于足下注射，以后的加強免疫于肌肉多點注射，每2周加強免疫1次，劑量與初次免疫相同。第2次加強免疫后，每隔2周耳緣靜脈取血測定效價變化，4次加強免疫后從耳緣靜脈采血，采用間接酶聯(lián)免疫法測定抗血清效價。待效價達到要求后，單獨用免疫原沖擊免疫1次，7d后采用頸動脈取血獲得抗血清，收集于50mL滅菌塑料離心管中，備用。1.2.3純化塑料離心管傾斜，與水平成50°于室溫下靜置4h,待血液凝固后，
8、于4°C冰箱過復(fù)，血清自然析出。將血清吸出后,3000r/min離心15min,取上清，與前面吸出的血清混在一起，再以4000r/min離心10min,然后加入0.2g/L疊氮鈉和500mL/L廿油，分裝，-20￡保存?zhèn)溆谩?.2.4效價測定采用飽和硫酸錢二次沉淀法純化抗體[9]o1:100稀釋DONOVA包被液，100uL/孔，
