抗cmtm4多克隆抗體的制備、 純化和鑒定

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1、抗CMTM4多克隆抗體的制備、純化和鑒定：李婷,郭曉歡,王彧,MarkusPlate,邵陸寧,宋泉聲,馬大龍,韓文玲【摘要】　　目的:制備抗CMTM4的多肽抗體并鑒定其性能。方法:通過TMHMM、DNAStar等軟件對CMTM4的3種剪接體,CMTM4v1,v2和v3的蛋白序列進(jìn)行分析,選取了4段序列合成多肽并與鑰孔戚血藍(lán)素（KLH）偶聯(lián)。其中第1、2、3條多肽為3種剪接體共有,混合后免疫家兔,制備Ab1;而第4條多肽為CMTM4v1所特有,單獨免疫家兔,制備Ab2。ELISA法檢測抗體效價。免疫親和層析法純

2、化后,進(jìn)行TM4多肽抗體Ab1和Ab2,效價分別達(dá)1∶105和1∶106。純化后的Ab1用于TM4v1和v2,并可用于免疫組織化學(xué)實驗;而Ab2僅可用于TM4v1。Ab1還可特異識別小鼠內(nèi)源性Cmtm4。結(jié)論:用多肽免疫家兔制備的2種抗CMTM4抗體不僅具有較高的效價以及特異性,并且Ab1還可以特異識別小鼠Cmtm4,為CMTM4的功能研究提供了有力的支持。【關(guān)鍵詞】CMTM4多肽抗體免疫親和純化　　[Abstract]AIM:Toprepare,purifyandcharacterizethepolyclo

3、nalantibodiesagainstCMTM4.METHODS:Fourpolypeptidesnamedpeptide1,2,3,and4aticsanalysisofthethreeisoformsofCMTM4,CMTM4v1,v2,andv3,andcoupledpethemocyanin(KLH)forimmunization.Amongthem,peptide1,2,and3,monforCMTM4v1,v2,andv3,ixedforimmunizationtopreparetheant

4、ibodys(Ab1);munoaffinitychromatography,Ab1andAb2munohistochemistryassays.RESULTS:ThetitersofAb1andAb2edtheirhighspecificity.Ab1couldalsobeusedforimmunohistochemistryanalysis,butAb2couldnot.ImmunohistochemistryanalysisonstratedthehighexpressionlevelofCMTM4inhu

5、mantestis,munohistochemistryanalysisverifiedthatAb1canalsorecognizemouseCmtm4.CONCLUSION:TanCMTM4munoaffinitychromatographypurification　　趨化素樣因子（chemokinelikefactor,CKLF）和趨化素樣因子超家族成員18（chemokinelikefactorsuperfamilymember18,CKLFSF18）是本研究室在國際上首次報道的一個新基因家族,

6、其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能特點介于經(jīng)典的趨化因子與4次跨膜蛋白之間[1,2]。由于該家族大部分成員存在不同剪接體,且每個基因至少有一種剪接體的編碼產(chǎn)物具有MARVEL結(jié)構(gòu)域,因此,2005年12月,CKLFSF18被國際人類基因命名委員會（HUGO）重新命名為CMTM18（CKLFlikeMARVELtransmembranedomaincontainingmember18）?！　MTM4有3種剪接體,CMTM4v1、v2和v3,分別編碼234、208和179個氨基酸;其中CMTM4v1和v2是主要形式

7、,在多種組織中廣泛表達(dá);而CMTM4v3僅存在于部分腎臟組織和胎盤組織中。CMTM4v2是該基因全長cDNA產(chǎn)物;目前,在小鼠中僅發(fā)現(xiàn)了Cmtm4v2（簡稱小鼠Cmtm4）,其氨基酸序列與人CMTM4v2同源性高達(dá)95.7%。CMTM4v1蛋白羧基端比v2多26個氨基酸。為了進(jìn)一步研究CMTM4的生物學(xué)功能,我們設(shè)計了CMTM4多肽,免疫家兔,制備多肽抗體;通過免疫親和層析方法,對其進(jìn)行純化;利用偶聯(lián)的二抗購自LICORBIOSCIENCE公司。弗氏佐劑購自Sigma公司。正常羊血清工作液、真核細(xì)胞表

8、達(dá)載體pcDNA3.1/MycHisB()購自Invitrogen公司;真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/MycHisB()CMTM4v1和pcDNA3.1/MycHisB()CMTM4v2為本實驗室構(gòu)建?！　?.2方法　　1.2.1生物信息學(xué)分析及CMTM4多肽的設(shè)計利用TMHMM（.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0/）軟件