抗嘔吐毒素多克隆抗體的制備、 純化及鑒定

《抗嘔吐毒素多克隆抗體的制備、 純化及鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。

1、抗嘔吐毒素多克隆抗體的制備、純化及鑒定：張銀志,王俊雙,孫秀蘭【摘要】　　目的:制備嘔吐毒素（DON）的多克隆抗體,并對抗體效價、特異性和抑制率進行鑒定。方法:采用EDC法合成了嘔吐毒素的完全抗原DONBSA,并通過免疫新西蘭大白兔,得到嘔吐毒素的多克隆抗體。結(jié)果:ELISA檢測出多抗中含有嘔吐毒素的特異性抗體,其效價最高為12800,其抑制率為50%時,DON的濃度為10mg/L,DON的最低檢測濃度為0.1mg/L。與結(jié)構(gòu)類似物T2毒素和NIV的交叉率分別為9.1%和4.9％。結(jié)論:嘔吐毒素經(jīng)過衍生化后制備出完全抗原,經(jīng)免

2、疫新西蘭大白兔后得到的多克隆抗體可以完全滿足ELISA檢測的需要?！娟P(guān)鍵詞】嘔吐毒素;多克隆抗體;鑒定　　嘔吐毒素(vomitoxin)又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol;DON))［1］,化學(xué)名為3α,7α,15一三羥基草鐮孢菌9烯8酮,屬單端孢霉烯族化合物。DON主要由禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum）和黃色鐮刀菌（Fusariumculmorum.）產(chǎn)生,廣泛存在于霉變的小麥、大麥、玉米等谷物籽實中,具有急性毒性、免疫毒性和胚胎毒性等危害［2-4］。目前國內(nèi)關(guān)于DON的檢測方法,主

3、要包括薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、LCAPCIMS和免疫學(xué)檢測方法。免疫學(xué)檢測方法具有特異性強、靈敏度高、實驗操作較簡單等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用真菌毒素檢測。目前國內(nèi)有少數(shù)幾家公司生產(chǎn)用于檢測嘔吐毒素的ELISA試劑盒,但生產(chǎn)中的主要試劑DON的完全抗原和多克隆抗體基本來自于國外,價格昂貴。我們在本實驗室合成了DON免疫抗原和檢測抗原的基礎(chǔ)上,制備了DON多克隆抗體,對抗體效價和特異性進行檢測,研究結(jié)果為建立嘔吐毒素的免疫檢測方法奠定了基礎(chǔ)?！　?材料和方法　　1.1材料酶標(biāo)儀、洗板機和可調(diào)試

4、移液器為ThermoLabsystem公司;冷凍離心機為Allegra公司;冷凍干燥機為Labconco公司;微量可調(diào)移液器:Finnpipette公司;96孔和16孔酶標(biāo)板:Corning公司。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、弗氏不完全佐劑(ICFA)、弗氏完全佐劑(CFA)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)均購自于Sigma公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（HRPIgG）、1乙基3(3二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)四甲基聯(lián)苯胺（TMB）上海生工生物技術(shù)服務(wù)工程公司;Tg、NHS1.38mg,

5、并分別溶于100μL的DMF中,待用。（2）分別稱取4mgBSA和MBSA溶于200μL,0.01mol/LpH7.4PBS中,冰箱中冷藏待用。將DON衍生物溶于350μL的DMF中,將NHS溶液加入,并在攪拌的同時緩慢加入DCC溶液,混合物在4℃避光反應(yīng)2h,經(jīng)離心提取上清夜,然后在攪拌的同時緩慢滴加BSA（或MBSA）溶液,4℃下緩慢攪拌反應(yīng)20h。（3）將產(chǎn)物溶液用0.01mol/LpH7.4PBS溶液在4℃下透析72h,每12h換透析液1次,溶液用小瓶分裝,真空冷凍干燥后,在4℃保存。制備包被抗原所用的蛋白為OVA,方法與

6、免疫抗原相同［5-8］。　　1.2.2抗血清的制備選3只健康新西蘭雄性大白兔,取其中1只作為陰性對照,剩余2只為實驗組。初次免疫時,將DONBSA凍干粉用生理鹽水溶解,用考馬斯亮藍(lán)法測定其中的蛋白質(zhì)含量,配成1g/L的溶液。將上述溶液與等量完全或不完全福氏佐劑用混合攪拌法將其充分乳化好后,于實驗動物背部皮下多點注射,1mL/只。初次免疫后的免疫稱為加強免疫,加強免疫用福氏不完全佐劑乳化,第1次加強免疫于足下注射,以后的加強免疫于肌肉多點注射,每2周加強免疫1次,劑量與初次免疫相同。第2次加強免疫后,每隔2周耳緣靜脈取血測定效價變

7、化,4次加強免疫后從耳緣靜脈采血,采用間接酶聯(lián)免疫法測定抗血清效價。待效價達(dá)到要求后,單獨用免疫原沖擊免疫1次,7d后采用頸動脈取血獲得抗血清,收集于50mL滅菌塑料離心管中,備用。　　1.2.3純化塑料離心管傾斜,與水平成50°于室溫下靜置4h,待血液凝固后,于4℃冰箱過夜,血清自然析出。將血清吸出后,3000r/min離心15min,取上清,與前面吸出的血清混在一起,再以4000r/min離心10min,然后加入0.2g/L疊氮鈉和500mL/L甘油,分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩！　?.2.4效價測定采用飽和硫酸銨二次沉淀法純化抗

8、體［9］。1∶100稀釋DONOVA包被液,100μL/孔,4℃冰箱過夜;棄去包被液,每孔注入200μL洗液,于振蕩器上振蕩3min,如此重復(fù)洗滌3次;拍干酶標(biāo)板,每孔加入150μL溶液封閉酶標(biāo)板,37℃封閉2h;洗滌3次,按100μL/孔加入抗