綠色熒光蛋白復(fù)習(xí)課程.ppt

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1、綠色熒光蛋白蛋白質(zhì)定位真核細(xì)胞具有復(fù)雜的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。每種細(xì)胞器都有一組特定的蛋白。真核細(xì)胞除葉綠體，線粒體能少量合成蛋白外，絕大部分蛋白是在胞漿或糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，最終運(yùn)至不同地點(diǎn)，形成成熟的蛋白質(zhì)并行使功能。譯產(chǎn)物中很大一部分是以前體蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信號(hào)，可引導(dǎo)蛋白質(zhì)在胞內(nèi)定位。蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位問題，是細(xì)胞生物學(xué)研究的中心問題，也是分子生物學(xué)研究的熱門話題。理解某些蛋白質(zhì)的定位從而分析探索其生物學(xué)功能，意義重大。蛋白質(zhì)定位蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位常用方法：蔗糖密度梯度離心；免疫膠體金標(biāo)記；免疫熒光；與GFP構(gòu)建融合基因表達(dá)融合蛋白；多糖序列分析等

2、。綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)GFP的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)GFP的發(fā)光機(jī)理GFP的熒光特性GFP的優(yōu)點(diǎn)GFP的改進(jìn)GFP的應(yīng)用2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)日裔美國(guó)科學(xué)家下村修美國(guó)科學(xué)家馬丁·查爾非美國(guó)華裔科學(xué)家錢永健諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)將化學(xué)獎(jiǎng)授予美籍日裔科學(xué)家下村修、美國(guó)科學(xué)家馬丁·沙爾菲和美籍華裔科學(xué)家錢永健三人，以表彰他們發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了綠色熒光蛋白質(zhì)技術(shù)。2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)下村修：于1962年在水母Aequoreavictoria發(fā)現(xiàn)并分離得到GFP，并發(fā)現(xiàn)該蛋白在紫外線下會(huì)發(fā)出明亮的綠色。馬丁·查爾菲：證明了G

3、FP作為多種生物學(xué)現(xiàn)象的發(fā)光遺傳標(biāo)記的價(jià)值，這一技術(shù)被廣泛運(yùn)用于生理學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。錢永?。鹤屓藗兝斫饬薌FP發(fā)出熒光的機(jī)制。同時(shí)拓展出綠色之外的可用于標(biāo)記的其他顏色，使得同一時(shí)刻跟蹤多個(gè)不同的生物學(xué)過程成為現(xiàn)實(shí)。GFP的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)一級(jí)結(jié)構(gòu)GFP由238個(gè)氨基酸殘基組成,分子量為26.9kDGFP的生色團(tuán)位于氨基酸序列64~69位GFP的第65、66、67位氨基酸分別是絲氨酸、脫氫酪氨酸、甘氨酸，為構(gòu)成GFP生色團(tuán)的核心GFP的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：由11條β桶狀結(jié)構(gòu)(β-barrel)繞成的一個(gè)圓柱體，直徑約3nm，長(zhǎng)約4nm。一條α螺旋纏繞在圓柱體的軸位置生

4、色團(tuán)附著在α螺旋上，幾乎完美地包埋于圓柱體中心這種方式被稱為β罐(β-can)晶體結(jié)構(gòu)GFP的發(fā)光機(jī)理GFP的生色團(tuán)是GFP發(fā)出熒光的物質(zhì)基礎(chǔ)。實(shí)質(zhì)：由第65、66、67位的絲氨酸—脫水酪氨酸—甘氨酸形成對(duì)羥苯甲基咪唑環(huán)酮GFP的熒光特性GFP的最大吸收峰為395nm(紫外)，并有一個(gè)479nm的副峰(藍(lán)光)；發(fā)射光譜最大峰值為509nm(綠光)盡管450～490nm(藍(lán)光)是GFP的副吸收峰，但由于長(zhǎng)波能量低，細(xì)胞忍受能力強(qiáng)，因此更適合于活體檢測(cè)。GFP的熒光特性GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相似，因此為熒光素FITC設(shè)計(jì)的熒光顯微鏡濾光片

5、組合同樣適用于GFP觀察。GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下的抗光漂白能力比熒光素強(qiáng)，特別在450～490nm藍(lán)光波長(zhǎng)下更穩(wěn)定。GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強(qiáng)還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?，但一旦重新暴露在空氣或氧氣中，GFP熒光便立即得到恢復(fù)。而一些弱還原劑并不影響GFP熒光。中度氧化劑對(duì)GFP熒光影響也不大，如生物材料的固定、脫水劑戊二酸或甲醛等。GFP的熒光特性通過對(duì)GFP的結(jié)構(gòu)和生化特性進(jìn)行改造，已獲得許多具有不同發(fā)射峰和激發(fā)峰的突變體，使GFP的熒光強(qiáng)度和作為報(bào)告基因的檢測(cè)靈敏度大大提高。項(xiàng)目激發(fā)峰發(fā)射峰野生型（wt-GFP）紅移突變體RSGF

6、P黃綠突變體YGFP藍(lán)色突變體BFP增強(qiáng)型突變體OGFP半衰期短的突變體395471-490513385385488509502-511527445510507GFP及其主要突變體的熒光特征nmGFP的優(yōu)點(diǎn)易于檢測(cè)熒光穩(wěn)定無毒害通用性易于構(gòu)建載體可進(jìn)行活細(xì)胞定時(shí)定位觀察易于得到突變體GFP的改進(jìn)盡管GFP作為報(bào)告基因或分子探針有許多無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，但是野生型GFP（wtGFP）具有一定的缺點(diǎn)：GFP有兩個(gè)激發(fā)峰影響了其特異性，并且長(zhǎng)波激發(fā)峰強(qiáng)度較小，不易觀察GFP合成及折疊產(chǎn)生熒光的過程慢，蛋白質(zhì)折疊受溫度影響大，表達(dá)量較低GFP在某些植物細(xì)胞中并不表達(dá)GFP

7、的改進(jìn)除去GFP基因中隱蔽型內(nèi)含子消除編碼蛋白的積累將GFP定位到特定細(xì)胞器中改變堿基組分更換GFP生色團(tuán)氨基酸插入植物內(nèi)含子增加增強(qiáng)子和更換強(qiáng)啟動(dòng)子GFP的應(yīng)用蛋白質(zhì)定位作為報(bào)告基因藥物篩選融合抗體生物傳感器其他方面GFP融合蛋白的構(gòu)建應(yīng)用亞克隆技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，通過愈傷組織轉(zhuǎn)化法、基因槍、顯微注射、電激轉(zhuǎn)化等方法轉(zhuǎn)化到合適的細(xì)胞，利用目的基因的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，如啟動(dòng)子和信號(hào)序列來控制融合基因的表達(dá)，最終得到融合蛋白，可以研究目的蛋白的定位。目的基因gfp基因融合基因轉(zhuǎn)化表達(dá)檢測(cè)GFP融合蛋白的構(gòu)建最關(guān)鍵的就是：要盡可能的不影響目的

8、蛋白的定位和功能。具體蛋白要具體分析。