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1、蛋白質(zhì)的分離、純化、表征第四章一蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。*蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。*蛋白質(zhì)的兩性電離大小(一)根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量公式:最低相對(duì)分子質(zhì)量=鐵的原子量×100鐵的百分含量二蛋白質(zhì)分子的大小與形狀（二）滲透壓法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量公式:R:氣體常數(shù)T:絕對(duì)溫度
2、C:溶質(zhì)濃度(g/m3)實(shí)際是測(cè)定幾個(gè)不同濃度的滲透壓。(三)蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和擴(kuò)散系數(shù)擴(kuò)散：由于濃度差引起的溶質(zhì)分子的凈遷移。菲克定律一：dm=-DAdcdtdxD：擴(kuò)散系數(shù)。當(dāng)濃度梯度為一個(gè)單位時(shí)，在一秒內(nèi)通過1厘米2面積所擴(kuò)散的溶質(zhì)量。菲克定律二：測(cè)定擴(kuò)散系數(shù)沉降速度法Mr=RTsD(1-Ｖρ)Ｖ:蛋白質(zhì)的偏微比容S：沉降系數(shù)S值ρ：溶劑密度D：擴(kuò)散系數(shù)(四)沉降分析法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量沉降平衡法Mr=2RTdln(c2/c1)(1-Ｖρ)Ｗ2(x22-x21)W:轉(zhuǎn)頭的角速度c2，c1：離轉(zhuǎn)中心x1，x2處的蛋白質(zhì)濃度(五)凝膠過濾法測(cè)定相
3、對(duì)分子質(zhì)量（六）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基結(jié)合一SDS分子后果：1掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。2改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象。公式：形狀X射線晶體結(jié)構(gòu)分析三蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀(一)膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達(dá)1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。*蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆
4、粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉（二）蛋白質(zhì)的沉淀在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會(huì)相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。沉淀方法*鹽析(saltprecipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。*有機(jī)溶劑深沉法如乙醇,丙酮等沉淀。*重金屬鹽沉淀法析金屬離子*生物堿試劑和某些酸類沉淀法析生物堿*加熱變性沉淀法析加熱前處理組分級(jí)處理細(xì)分級(jí)處理四蛋白質(zhì)分離純化的一般原則根據(jù)分子大小不同
5、透析、超過濾、梯度離心、凝膠過濾根據(jù)溶解度差別等電點(diǎn)沉淀、PH控制、蛋白質(zhì)鹽溶和鹽析、有機(jī)溶劑、溫度根據(jù)電荷不同電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、等電聚焦、層析聚焦、離子交換層析五蛋白質(zhì)分離純化的方法選擇性吸附的純化方法羥磷灰石層析、疏水作用層析對(duì)配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法高效液相層析和快速蛋白質(zhì)液相層析1幾種重要的蛋白質(zhì)電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。*等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。2層析層析(chromatography)分離蛋白
6、質(zhì)的原理待分離蛋白質(zhì)溶液（流動(dòng)相）經(jīng)過一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)分離常用的層析方法*離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。*凝膠過濾(gelfiltration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。目錄目錄3超速離心*超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。*蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為用沉降系數(shù)(sedimenta
7、tioncoefficient,S)表示,沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān)。因?yàn)槌两迪禂?shù)S大體上和分子量成正比關(guān)系，故可應(yīng)用超速離心法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，但對(duì)分子形狀的高度不對(duì)稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用。六蛋白質(zhì)含量測(cè)定與純度鑒定含量測(cè)定凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法等純度鑒定電泳、沉降、HPLC、溶解度等
