第3章-蛋白質(zhì)的分離、純化和表征.ppt

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1、Protein第3章蛋白質(zhì)的分離純化和表征蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：當(dāng)溶液在某一定pH值時(shí)，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場(chǎng)中即不向陽極移動(dòng)也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場(chǎng)中不移動(dòng)。在外液pH低于等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)；在外液pH高于等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳—帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象。一、蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn)pI通常在6.0左右一、蛋白質(zhì)

2、的兩性電離及等電點(diǎn)二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）膠體性質(zhì)（colloidalsystem）膠體溶液的特點(diǎn)：分子直徑在1-100nm內(nèi)溶于水不易聚集沉淀大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：1.同種蛋白帶同種電荷，相互排斥2.水膜彈性蛋白質(zhì)溶液具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動(dòng)以及不能通過半透膜等性質(zhì)（二）蛋白質(zhì)的沉淀Pr從膠體溶液中析出Ⅰ可逆沉淀：溫和條件，改變?nèi)芤簆H或Pr所帶電荷Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化適當(dāng)條件下可重新溶解——非變性沉淀pI沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等不可逆沉淀強(qiáng)烈

3、沉淀?xiàng)l件破壞Pr膠體溶液穩(wěn)定性也破壞Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沉淀不能再重新溶解——變性沉淀如加熱沉淀、強(qiáng)酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等Ⅱ1.鹽析法加入中性鹽脫去蛋白質(zhì)的水化層，鹽析一般不引起變性等電點(diǎn)沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入NaCl后沉淀溶解—鹽溶原因？鹽溶—鹽析分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶鹽析向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)會(huì)沉淀析出原因？蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀鹽析（（NH4）2SO4）2.有機(jī)溶劑沉淀脫去水化層降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互

4、作用，減少蛋白質(zhì)表面可解離基團(tuán)的離子化程度3.等電點(diǎn)沉淀4.重金屬鹽沉淀與帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)結(jié)成不溶性鹽5.生物堿試劑和某些酸類沉淀與帶正電荷蛋白質(zhì)生成不溶性鹽6.加熱變性沉淀天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，破壞水化層及帶電狀態(tài)一.分離純化蛋白質(zhì)的意義1.研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能：要求純度高，不變性；2.提取活性的酶或蛋白質(zhì)：必須保持天然活性狀態(tài)；3.作為藥物或食品添加劑：純度要求一般。二、蛋白質(zhì)提純的總目標(biāo)：增加制品純度或比活力，設(shè)法除去變性的蛋白質(zhì)和其他雜蛋白，且希望所得的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到最高值。三、蛋白質(zhì)分離純化的一般

5、原則三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加制品純度或比活1.前處理：因動(dòng)/植物/細(xì)菌而異2.粗分級(jí)分離：采用鹽析/等電點(diǎn)沉淀/有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法3.細(xì)分級(jí)分離：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等4.結(jié)晶2、根據(jù)溶解度分等電點(diǎn)沉淀鹽析（常用硫酸銨）有機(jī)溶劑沉淀3、根據(jù)電離性質(zhì)分電泳離子交換層析1、根據(jù)分子大小分透析或超濾離心沉淀凝膠過濾層析4、特異親和力：親和層析沉降平衡離心法沉降速度離心法四、蛋白質(zhì)的分離純化方法五、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法1、透析和超過濾利用蛋白

6、質(zhì)分子不能透過半透膜將其與小分子物質(zhì)分開半透膜為玻璃紙或纖維素材料凝膠過濾凝膠過濾所用介質(zhì)為凝膠珠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)一定型號(hào)的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外洗脫時(shí)大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積?。恍》肿釉陬w粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長(zhǎng)，后洗脫下來，洗脫體積大.測(cè)定蛋白質(zhì)分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex（二）利用溶解度差別的純化方法1.等電點(diǎn)沉淀調(diào)整溶液pH，不同蛋白在各自pI處依次沉淀2.鹽溶和鹽析2.鹽析在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的

7、強(qiáng)電解質(zhì)鹽如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋質(zhì)分子表面的水化層，中和它們的電荷，因而使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。而低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶。鹽析的機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜。鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性3.有機(jī)溶劑分級(jí)分離法爭(zhēng)奪水化膜降低介電常數(shù)電泳原理蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)所帶總電荷不為0分子大小不同，電場(chǎng)中移動(dòng)速度也不同蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)(IsoelectricpointpI)，蛋白質(zhì)的溶

8、解度最小，在電場(chǎng)中不移動(dòng)。在不同的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。在等電點(diǎn)偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)；在等電點(diǎn)偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳(Electrophoresis)。水平式平板凝膠電泳垂直式平板凝膠電泳雙向電泳蛋白質(zhì)雙向電泳離子交換層析六離子交換層析（七）利用蛋白質(zhì)選擇性吸附的性質(zhì)羥磷石灰