第7章蛋白質(zhì)的分離純化和表征ppt課件.ppt

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1、Protein第7章蛋白質(zhì)的分離純化和表征蛋白質(zhì)含有酸/堿AA殘基具有兩性堿/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右一、蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的分子量一般在一萬至一百萬道爾頓之間1道爾頓＝1×C12絕對(duì)質(zhì)量/12≈1.66×10-27千克二、蛋白質(zhì)分子的大?。ㄒ唬└鶕?jù)化學(xué)組成測定最小分子量1、測定蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量2、假設(shè)蛋白質(zhì)中僅含一個(gè)鐵原子最低相對(duì)分子質(zhì)量=100*55.8/鐵的百分含量（二）SDS－PAGE測定相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)顆粒電泳時(shí)遷移率取決于：所帶電荷分子量分子形狀十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基極性親水烷基親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）遷移率與電

2、荷和形狀無關(guān)，僅取決于相對(duì)分子質(zhì)量巰基乙醇破壞二硫鍵（三）凝膠過濾法測定相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)混合樣凝凝膠法只適于球狀蛋白分子測量三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）膠體性質(zhì)（colloidalsystem）膠體溶液的特點(diǎn)：分子直徑在1-100nm內(nèi)溶于水不易聚集沉淀大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：1.同種蛋白帶同種電荷，相互排斥2.水膜彈性蛋白質(zhì)溶液具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動(dòng)以及不能通過半透膜等性質(zhì)（二）蛋白質(zhì)的沉淀Pr從膠體溶液中析出Ⅰ可逆沉淀：溫和條件，改變?nèi)芤簆H或Pr所帶電荷Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化適當(dāng)條件下可重新溶解——非變性沉淀pI

3、沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等不可逆沉淀強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件破壞Pr膠體溶液穩(wěn)定性也破壞Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沉淀不能再重新溶解——變性沉淀如加熱沉淀、強(qiáng)酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等Ⅱ1.鹽析法加入中性鹽脫去蛋白質(zhì)的水化層，鹽析一般不引起變性等電點(diǎn)沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入NaCl后沉淀溶解—鹽溶原因？鹽溶—鹽析分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶鹽析向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)會(huì)沉淀析出原因？蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀鹽析（（NH4）2SO4）2.有機(jī)溶劑沉淀脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用3.等電

4、點(diǎn)沉淀4.重金屬鹽沉淀與帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)結(jié)成不溶性鹽5.生物堿試劑和某些酸類沉淀與帶正電荷蛋白質(zhì)生成不溶性鹽6.加熱變性沉淀天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，破壞水化層及帶電狀態(tài)四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加制品純度或比活1.前處理：因動(dòng)/植物/細(xì)菌而異2.粗分級(jí)分離：采用鹽析/等電點(diǎn)沉淀/有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法3.細(xì)分級(jí)分離：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等4.結(jié)晶五、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法1、透析和超過濾利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜將其與小分子物質(zhì)分開半透膜為玻璃紙或纖維素材料血液透析小分子溶出小分子被帶出透析機(jī)透析液加壓

5、血液2、密度梯度（區(qū)帶）離心60000~80000轉(zhuǎn)/分重力60萬～80萬倍3、凝膠過濾（二）利用溶解度差別的純化方法1.等電點(diǎn)沉淀調(diào)整溶液pH不同蛋白在各自pI處依次沉淀2.鹽溶和鹽析3.有機(jī)溶劑分級(jí)分離法降低介電常數(shù)爭奪水化膜（三)根據(jù)電荷不同的分離方法—電泳原理：蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)所帶總電荷不為0分子大小不同，電場中移動(dòng)速度也不同等電聚焦電泳雙向電泳離子交換層析（四）利用蛋白質(zhì)選擇性吸附的性質(zhì)羥磷石灰層析疏水作用層析（五）利用對(duì)配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法親和色譜顆粒具有極強(qiáng)的專一性六、蛋白質(zhì)含量測定和純度鑒定（略）