高效液相色譜檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程.doc

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1、高效液相色譜檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、一、目的：建立高效液相色譜檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，使其操作規(guī)范化。二、依據(jù)：中國(guó)藥典2010版二部附錄28。三、適用范圍：適用于高效液相色譜檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作。四、責(zé)任者：質(zhì)量部檢驗(yàn)人員。五、正文：1.簡(jiǎn)述高效液相色譜法是一種現(xiàn)代液體色譜法，其基本方法是將具一定極性的單一溶劑或不同比例的混合溶液，作為流動(dòng)相，用泵將流動(dòng)相注入裝有填充劑的色譜柱，注入的供試品被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)進(jìn)行分離后，各成分先后進(jìn)入檢測(cè)器，用記錄儀或數(shù)據(jù)處理裝置記錄色譜圖或進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到測(cè)定結(jié)果。由于應(yīng)用了各種特性的

2、微粒填料和加壓的液體流動(dòng)相，本法具有分離性能高，分析速度快的特點(diǎn)。高效液相色譜法適用于能在特定填充劑的色譜柱上進(jìn)行分離的藥品的分析測(cè)定，特別是多組分藥品的測(cè)定、雜質(zhì)檢查和大分子物質(zhì)的測(cè)定。有的藥品需在色譜分離前或后經(jīng)過(guò)衍生化反應(yīng)方能進(jìn)行分離或檢測(cè)。常用的色譜柱填充劑有：硅膠，用于正相色譜；化學(xué)鍵合固定相，根據(jù)鍵合的基團(tuán)不同可用于反相或正相色譜，其中最常用的是十八烷基硅烷（又稱(chēng)ODS）鍵合硅膠，可用于反相色譜或離子對(duì)色譜；離子交換填料，用于離子交換色譜；具一定孔徑的大孔填料，用于排阻色譜。高效液相色譜儀基本由泵

3、、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。檢測(cè)器最常用的為可變波長(zhǎng)紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器，其他檢測(cè)器有如示差折光檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等。色譜信息的收集和處理常用積分儀或數(shù)據(jù)工作站進(jìn)行。梯度洗脫，可用兩臺(tái)泵或單臺(tái)泵加比例閥進(jìn)行程控實(shí)現(xiàn)。2高效液相色譜儀的使用要求2.1按國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程匯編中“實(shí)驗(yàn)室液相色譜儀檢定規(guī)程（JJG705-90）”的規(guī)定作定期檢定，應(yīng)符合規(guī)定。2.2儀器各部件應(yīng)能正常工作，管路為無(wú)死體積連結(jié)，流路中無(wú)堵塞或漏液，在設(shè)定的檢測(cè)器靈敏度條件下，色譜基線噪音和漂移應(yīng)能滿足分

4、析要求。2.3具體儀器在使用前應(yīng)詳細(xì)參閱各操作說(shuō)明書(shū)。3.操作前的準(zhǔn)備3.1流動(dòng)相的制備用高純度的試劑配制流動(dòng)相，必要時(shí)照紫外分光光度法進(jìn)行溶劑檢查，應(yīng)符合要求；水應(yīng)為新鮮制備的高純水，可用超級(jí)純水器制得或用重蒸餾水。凡規(guī)定的pH值的流動(dòng)相，應(yīng)使用精密pH計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)。配制好的流動(dòng)相應(yīng)通過(guò)適宜的0.45μm濾膜濾過(guò)。用前脫氣。應(yīng)配制足量的流動(dòng)相及時(shí)待用。3.2供試溶液的配制供試品用規(guī)定溶劑配制成供試溶液。定量測(cè)定時(shí)，對(duì)照品溶液和樣品供試溶液均就分別配制2份，供試溶液在注入色譜儀前，一般應(yīng)經(jīng)適宜的0.45μm濾膜

5、濾過(guò)。必要時(shí)，在配制供試溶液前，樣品需經(jīng)提取凈化，以免對(duì)色譜系統(tǒng)產(chǎn)生污染或?qū)ιV干擾。3.3檢查上次使用記錄和儀器狀態(tài)檢查色譜柱是否適用于本次試驗(yàn)，色譜柱進(jìn)出口位置是否與流動(dòng)相的流向一致，原保存溶劑與現(xiàn)用流動(dòng)相能否互溶，流動(dòng)相的pH值與該色譜柱是否相應(yīng)，儀器是否完好，儀器的各開(kāi)關(guān)位置是否處于關(guān)斷的位置。4.操作4.1泵的操作4.1.1用流動(dòng)相沖洗濾器，再把濾器浸入流動(dòng)相中，啟動(dòng)泵。PURGE4.1.2打開(kāi)泵的排放閥，用專(zhuān)用注射器從閥口抽出流動(dòng)相約20ml，設(shè)置高流速（如9ml/min）或用沖洗鍵進(jìn)行充泵排氣，

6、觀察出口處流動(dòng)相呈連續(xù)液流后，將流速逐步回零或停止（STOP）沖洗，關(guān)閉排放閥。4.1.3將流速調(diào)節(jié)至分析用流速，對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡，同時(shí)觀察壓力指示應(yīng)穩(wěn)定，用干燥濾紙片的邊緣檢查柱管各連接處應(yīng)無(wú)滲漏。初始平衡時(shí)間一般約需30分鐘，如為梯度洗脫，應(yīng)在程序器上設(shè)置梯度狀態(tài)，用初始比例的流動(dòng)相對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡。4.2紫外可見(jiàn)檢測(cè)器和色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)的操作。4.2.1開(kāi)啟檢測(cè)器電源開(kāi)關(guān)，選擇光源（氘燈或鎢燈），選定檢測(cè)波長(zhǎng)，待穩(wěn)定后，測(cè)試參比和樣品光路的信號(hào)應(yīng)符合要求，設(shè)置吸收度方式和檢測(cè)響應(yīng)時(shí)間（一般不大于1秒），設(shè)

7、置滿刻度吸收值（適用于記錄儀）。4.2.2開(kāi)啟色譜處理機(jī)，設(shè)定處理方法，初步設(shè)定衰減、紙速、記錄時(shí)間、最小峰面積參數(shù)，或設(shè)定記錄儀的紙速和衰減。4.2.3進(jìn)行檢測(cè)器回零操作，檢查處理機(jī)的電平（LEVEL），應(yīng)符合要求，或檢查記錄儀的筆應(yīng)處在設(shè)定的起始位置，如有變動(dòng)，可繼續(xù)回零操作直至符合要求。4.2.4記錄基線，待穩(wěn)定后，進(jìn)行處理機(jī)斜率測(cè)試，符合要求后方能進(jìn)行操作。4.3進(jìn)樣操作（六通閥式進(jìn)樣器）。4.3.1把進(jìn)樣器手柄放在載樣位置（LOAD）。4.3.2用供試溶液清洗配套的注射器，再抽取適量，如用定量環(huán)（L

8、OOP）載樣，則注射器抽取量應(yīng)不少于定量環(huán)容積的5倍，用微量注射器定容進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量不得多于環(huán)容積50%，在排除氣泡后方能向進(jìn)樣器中注入供試溶液。4.3.3把注射器的平頭針直插至進(jìn)樣器的底部，注入供試溶液，除另有規(guī)定外，注射器不應(yīng)取下。4.3.4把手柄掛至注樣位置（INJECT），定量環(huán)內(nèi)供試溶液，即被流動(dòng)相帶入流路。4.4色譜數(shù)據(jù)的收集和處理4.4.1注樣的同時(shí)啟動(dòng)數(shù)據(jù)處理機(jī)，開(kāi)始采集和處理色譜信