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1、ELISA雙抗體夾心法檢測抗原王春復旦大學免疫學系復旦大學免疫生物學研究所<<細胞與分子免疫學技術>>酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)一種固相酶免疫測定技術，利用酶標記的抗原或者抗體，在固相載體上定量或定性測定特異性抗體、可溶性抗原及細胞表面抗原。1971年由瑞典學者Engrall和Perlmann,荷蘭學者weeman和Schuurs報道；開創(chuàng)了運用酶標記免疫技術進行液體標本中微量物質測定的實驗方法；ELISA-測抗原（Ag）或抗體（Ab）三
2、要素抗原或抗體的固相化：已知的Ag/Ab結合到固相載體表面，并保持其免疫活性；抗原或抗體的酶標記：酶標Ag/Ab,并保持其免疫活性和酶活性；底物顯色：底物被酶催化成為有色產(chǎn)物—定性和定量–放大免疫反應的信號基本原理高度特異性：保持抗原抗體反應的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg水平微量檢測定性定量檢測：反應液顏色深淺或光密度值基本特點基本類型抗體測定法間接法檢測特異性抗體抗原測定法直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應用生物素-親和素雙抗體夾心EL
3、ISA法基本類型抗體測定法間接法檢測特異性抗體抗原測定法直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法顯色間接法檢測特異性抗體包被已知抗原與待測抗體孵育與酶標抗體孵育加入底物包被已知抗原優(yōu)點:只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法操作簡單迅捷缺點：可重復性差通常用于抗體效價的檢測和某些疾病的早期診斷基本類型抗體測定法間接法檢測特異性抗體抗原測定法直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體
4、夾心法檢測可溶性抗原）應用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法直接競爭法檢測可溶性抗原原理：待檢抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合；待檢抗原含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。優(yōu)點：待檢抗原只需要一個抗原決定簇，適合小分子抗原，如，激素，藥物等；操作步驟簡單快捷，只需要一個保溫洗滌過程缺點：酶標記抗體用量大；定量檢測的靈敏度和重復性存在不足?；绢愋涂贵w測定法間接法檢測特異性抗體抗原測定法直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應用生物
5、素-親和素雙抗體夾心ELISA法改良雙抗夾心法雙抗體夾心法檢測可溶性抗原雙抗夾心法優(yōu)點：待測抗原需要≥2個抗原決定簇，所以適合大分子抗原的檢測，一般在分子量5000D以上；由于增加了一層抗體，提高了特異性檢測的靈敏度，尤其是改良雙抗夾心法；只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物就可以建立此法；重復性較好；缺點：操作復雜，費時費力基本類型抗體測定法間接法檢測特異性抗體抗原測定法直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應用生物素-親和素
6、雙抗體夾心ELISA法應用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法 （BA-ELISA法）間接包被放大終末反應BA-ELISA原理BA-ELISA是在常規(guī)ELISA原理的基礎上，結合生物素(B，biotin)與親和素(A，avidin)間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統(tǒng)。生物素是動植物體內(nèi)廣泛分布的一種小分子生長因子，又名輔酶R或維生素H；親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，對生物素有非常高的親和力；（鏈酶親和素是從鏈霉菌中提取，對載體吸附性比前者低）親和素與生物素都可與蛋白質(包括抗原、抗體、酶等)
7、、熒光素等分子結合而不影響后者的生物活性，是理想的標記劑；結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。實驗材料小鼠INF-γ檢測試劑盒的組成：CaptureAb：purifiedanti-mouseIFN-γDetectionAb：biotin-conjugate-anti-mouseIFN-γAvidin-conjugate-HRPStandard：recombinantmouseIFN
8、-γ（定量測定）Coatingbuffer5×AssaydiluentTMBsolution待測樣品----經(jīng)ConA活化的小鼠淋巴細胞培養(yǎng)上清ELISA操作要點樣品的保存試劑的準備固相載體包被加樣孵育(溫育）洗滌顯色和比色樣本的制備與保存：血清樣品和細胞培養(yǎng)上清：5天內(nèi)測定，可以放置于4℃，超過一周，-80℃保存；ConA活化的小鼠淋巴細胞培養(yǎng)上清：分別于活化后不同時間點收集培養(yǎng)的細胞，2000rpm，4℃離心分離上清，冰上
