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1、第44卷分析化學(FENXIHUAXUE)研究報告第4期2016年4月ChineseJournalofAnalyticalChemistry625～632DOI：10．11895／]．issn．0253-3820．151007基于間接競爭原理的流式微球技術(shù)快速檢測麥芽中赭曲霉毒素A肖昌彬，劉秋桃，豆小文楊美華孔維軍萬麗“。(成都中醫(yī)藥大學藥學院，成都611137)(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)科大學，藥用植物研究所，北京100193)(遼寧醫(yī)學院藥學院，錦州121001)摘要建立了一種快速、靈敏檢測中藥麥芽中赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)含量的間接競爭流式微球方法。麥芽樣
2、品經(jīng)60％甲醇／PBS提取，加入20％甲醇／PBS溶液稀釋5倍后，離心取上清液制備樣品。在編碼熒光微球上偶聯(lián)牛血清白蛋白．OTA(BSA—OTA)復合物，與樣品中OTA競爭結(jié)合抗OTA特異性抗體，然后加入FITC．I孵育，離心洗滌后，用流式細胞儀檢測微球表面的平均熒光強度，實現(xiàn)樣品中OTA的準確定性定量測定。本方法檢測OTA的半數(shù)抑制濃度Ic卯為1．20ng／mL，相關(guān)系數(shù)R=0．9892，檢出限(IC。)為0．12ng／mL，加樣回收率為93．9％～97．4％，RSD<3．6％。16份實際麥芽樣品中檢測到2個陽性樣品，OTA的最高含量為3．83~g／kg，未超出歐盟的OTA限量標準
3、，與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS／MS)法檢測結(jié)果相一致。本方法簡單、快速、靈敏、可靠，可拓展用于其它復雜基質(zhì)中多種真菌毒素的定性與定量檢測。關(guān)鍵詞流式微球技術(shù)；間接競爭；麥芽；赭曲霉毒素A；快速檢測1引言赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)是由曲霉屬和青霉屬真菌產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物?，具有嚴重的致癌、致畸、致突變及肝細胞毒性、免疫抑制和生殖紊亂等毒性作用J，已被國際癌癥研究機構(gòu)列為人類可能的致癌物(2B級)，也被美國國家毒理學計劃定為極有可能對人類產(chǎn)生致癌性的物質(zhì)。OTA是食品、農(nóng)產(chǎn)品及農(nóng)作物、藥用植物中主要的外源性有害污染物，不僅會影響相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量，而且對人類健康
4、和生命安全存在潛在的威脅_5J。世界各國已對其制定了嚴格的限量標準，如歐盟聯(lián)合委員會規(guī)定谷物中OTA的限量為5．0kg，谷物制品及其相關(guān)產(chǎn)品中OTA的限量為3．0g／kg，酒和葡萄汁飲料中OTA的限量為2．0g／J。因此，開發(fā)簡單、快速、準確、靈敏且特異性的檢測方法，對于保證食品、農(nóng)產(chǎn)品及藥用植物的安全使用以及保證人類健康至關(guān)重要J。OTA的檢測大多采用儀器分析技術(shù)，如液相色譜．熒光法(HPLC—FLD)及串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS／MS)等。雖然這些分析方法具有靈敏、準確的特點，但需大型的昂貴的儀器，操作步驟繁瑣、耗時；此外，食品、農(nóng)產(chǎn)品、中藥材等基質(zhì)成分復雜，需要嚴格的前處理和凈化步
5、驟，給實際操作帶來諸多困難。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)以其高特異性、高選擇性、對樣品純度要求不高及樣品處理量大的優(yōu)點，而被用于復雜基質(zhì)中OTA的快速篩查檢測_1，J，但存在靈敏度低、重復性差等不足。流式微球技術(shù)(Cytometricbeadarray，CBA)馴以一系列熒光強度不同的編碼微球為載體，通過激光束激發(fā)熒光編碼微球，利用流式細胞儀分析微球本身和表面熒光強度完成數(shù)據(jù)收集和分析，可實現(xiàn)復雜基質(zhì)中目標物靈敏、準確的快速檢測，且重復性和穩(wěn)定性好、分析時間短、假陽率低。該技術(shù)已被應(yīng)用到多種基質(zhì)中大分子及小分子化合物的高通量檢測卜。OTA為小分子化合物，具有半抗原性、分子量小、單一
6、抗原表位、本身不具免疫原性等特點J，多采用基于“抗體．抗原”特異性識別的競爭型流式微球免疫分析技術(shù)，而間接競爭模式因其偶聯(lián)過程中不損傷，且不阻礙抗體與抗原的識別位點等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用[27,28]。2015-12-23收稿；2016-03-07接受本文系國家自然科學基金(Nos．81473346，81274072)和協(xié)和新星人才支持計劃資助+E—mail：kongwj302@126．corn；wanli8801@163．corn626分析化學第44卷麥芽為中醫(yī)臨床常用的中藥材，具有行氣消食、健脾開胃、退乳消腫_2等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，麥芽還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抑制膽固醇與血脂
7、增加、預防心血管疾病、增強免疫能力等作用。麥芽還是糧食、飼料和釀酒的重要原料。麥芽的制備加工過程中_3，極易霉變變質(zhì)產(chǎn)生真菌毒素如OTA等。所以，有必要建立適合麥芽中OTA的現(xiàn)場、靈敏、高效的檢測方法。本研究建立了一種基于間接競爭模式的流式微球方法，在熒光微球表面偶聯(lián)牛血清白蛋白(BSA)一OTA復合物，與樣品中OTA共同競爭特異性抗體，加入熒光標記的二抗探針后，通過流式細胞儀檢測微球本體和表面熒光，實現(xiàn)OTA的定性定量測定。本方法操作簡單、檢測通量大、檢
