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1、細(xì)胞活體染色技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)細(xì)胞活體染色的方法。觀察動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體，液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布。2細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)3實(shí)驗(yàn)原理一般的生物材料不能穿透細(xì)胞膜，只有當(dāng)細(xì)胞被固定后，細(xì)胞膜被破壞，染料才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。但是，有一些染料（稱“活體染料”）卻能進(jìn)入活細(xì)胞，它們是一些無(wú)毒或毒性很小的染色劑，能使細(xì)胞中某些特定結(jié)構(gòu)著色?；铙w染料基本上不影響或很少影響細(xì)胞的生命活動(dòng)。4活染法彌補(bǔ)了活觀察法不能顯示細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)的不足，也避免了固定染色法對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破環(huán)和造成人為假象的弊病。遺憾的是，適宜活體染色的染料
2、較少，能顯示出的結(jié)構(gòu)和種類也不多。活體染色分為體內(nèi)活染和體外活染兩種。前者是將染料注射于生物體內(nèi)，染色后再取材觀察。后者是取材后，對(duì)離體的活細(xì)胞進(jìn)行染色。為保持離體細(xì)胞的正常存活，染色時(shí)需供給細(xì)胞以正常的溫度，滲透壓，PH等。5活體染色6較為常見(jiàn)的活體染色劑詹納斯綠B(JanusgreenB)中性紅臺(tái)盼藍(lán)(trypanblue)7詹納斯綠B(JanusgreenB)專一用于線粒體的染色。它可以和線粒體中的細(xì)胞色素C氧化酶結(jié)合，保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))呈藍(lán)綠色,而在周圍的細(xì)胞質(zhì)中染料被還原,成為無(wú)
3、色狀態(tài)。必須指出的是，只有具有活性的細(xì)胞色素C氧化酶才能夠把詹納斯綠B氧化，從而使它顯出顏色8人口腔上皮細(xì)胞的線粒體分布在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中務(wù)必保持所取的材料的活性。通常，需要把生物材料置于０℃～４℃的冰水浴低溫中，并且操作要迅速。910中性紅中性紅是液泡系的特殊活體染色劑，它可將不同發(fā)育時(shí)期的液泡染成不同深度的紅色，在細(xì)胞處于生活狀態(tài)下細(xì)胞質(zhì)和核不被染色，該染料對(duì)液泡系具有一定專一性。1112液泡系的中性紅染色點(diǎn)經(jīng)觀察13臺(tái)盼藍(lán)(trypanblue)臺(tái)盼藍(lán)：正常的活細(xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，
4、使之不能夠進(jìn)入胞內(nèi)；而喪失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。通常認(rèn)為細(xì)胞膜完整性喪失，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡，這與中性紅作用相反。因此，借助臺(tái)盼藍(lán)染色可以非常簡(jiǎn)便、快速地區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)是組織和細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的死細(xì)胞鑒定染色方法之一。注意凋亡小體也有臺(tái)盼藍(lán)拒染現(xiàn)象。1415實(shí)驗(yàn)用品材料：黃豆根尖、洋蔥、小鼠。器械：顯微鏡、鑷子、刀片、’剪刀、解剖針、表面皿、載玻片、蓋玻片、吸管、收水紙等。試劑：Ringer氏液1／3000中性紅溶液1／5000詹納斯綠B臺(tái)盼
5、藍(lán)染色液香柏油、二甲苯、蒸餾水等16實(shí)驗(yàn)方法1.液泡系的中性紅活體染色取黃豆芽的根尖處的縱切面↓于載玻片上的中性紅染液中染色5─10min↓吸去染液，滴一滴Ringer液↓蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢172.線粒體的活體染色⑴用植物細(xì)胞觀察線粒體的活體染色撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊↓于載玻片上的1/5000JanusgreenB染色30min↓吸去染液，滴一滴Ringer液↓蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢18娶取鼠肝肝組織一小塊，放入盛有Ringer氏液表面皿中洗去血液↓于載玻片上的1/5000JanusgreenB染色
6、30min↓撕開組織塊，這樣溶液中會(huì)有一些細(xì)胞或細(xì)胞群↓吸取溶液，放在載玻片的Ringer氏液中↓墊上兩根短頭發(fā)，蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢⑵用動(dòng)物細(xì)胞觀察線粒體的活體染色為什么要用油鏡觀察，植物細(xì)胞卻不用？為什么要墊上兩根短頭發(fā)？思考193.人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上↓滴2滴1/5000JanusgreenB染液↓用牙簽口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞↓刮下的粘液狀物放大載玻片的染液滴中↓染色10~l5min(注意不可使染液干燥，必要時(shí)可再加滴染液)↓蓋
7、上蓋玻片,顯微鏡下觀察204.臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞死活取小鼠腹腔水細(xì)胞于潔凈載玻片上↓滴加1%臺(tái)盼藍(lán)1滴↓蓋上蓋玻片于顯微鏡下進(jìn)行鏡檢21注意事項(xiàng)對(duì)口腔上皮細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)不可使染劑干燥，可適當(dāng)補(bǔ)加染液。在對(duì)植物進(jìn)行觀察時(shí)一定要讓材料盡量展開。詹納斯綠B(JanusgreenB)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。試驗(yàn)中速度要快，以免組織細(xì)胞死亡22思考題所觀察到的液泡大小是否有差別，染色深度是否一樣，并繪圖加以說(shuō)明。所觀察到線粒體分布在細(xì)胞何處．呈什么顏色，其形狀如何，繪圖加以說(shuō)明。比較線粒體在動(dòng)
8、、植物中的分布、顏色，其形狀如何?23thanks24
