禽流感(H9亞型)制造及檢驗試行規(guī)程.doc

禽流感(H9亞型)制造及檢驗試行規(guī)程.doc

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1、禽流感(H9亞型)制造及檢驗試行規(guī)程本品系用A型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/Jiangsu/JY/99(II9N2)株(簡稱JY株)接種易感雞胚,收獲胚液,超濾濃縮,經(jīng)甲醛溶液滅活后,與礦物油住劑混合乳化制成。用于預防H9亞型禽流感。毒種1.1制苗及效檢用H9亞型AIV毒種均為JY株,由揚州優(yōu)邦生物制藥有限公司鑒定、保管和供應(yīng)。1.2毒種標準1.2.1AIVJY株毒種標準1.2.1.1病毒含量將毒種用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋,取10°、10=10*3個稀釋度,各尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5個,每胚0.1m

2、l,置36?37°C繼續(xù)孵育,24小吋以前死亡的雞胚棄去不計,在24?96小吋死亡的雞胚隨吋取出,收獲雞胚液,同一稀釋度的胚液等量混合,按稀釋度分別測定紅細胞凝集價,至96小時,取出所有活胚,逐個收獲雞胚液,分別測定紅細胞凝集價,凝集價21:64者判為感染,計算EIDsoo每0.1ml病毒含量應(yīng)^107<)EID5oo1.2.1.2紅細胞凝集價按現(xiàn)行《屮國獸藥典》附錄進行,含毒雞胚液對1%雞紅細胞凝集價應(yīng)Ml:256。1.2.1.3對雞胚的毒力用滅菌生理鹽水將毒種作1:10000稀釋,尿囊腔內(nèi)接種9?11日齡SPF雞胚20枚

3、,每胚0.lml(約103OEID5o),接種后24?96小吋內(nèi),應(yīng)至少有18個雞胚死亡。剖檢觀察,死亡雞胚應(yīng)出現(xiàn)全身出血、明顯水腫、肝臟壞死等病變。121.4對雛雞的毒力用滅菌生理鹽水將毒種作1:10稀釋,翅靜脈接種4?8周齡SPF雞10只,每只雞0.2ml,接種后觀察10R,雞只應(yīng)不出現(xiàn)死亡或明顯異常反應(yīng)但有個別雞出現(xiàn)輕微的呼吸道癥狀。接毒后第5R,采集泄殖腔拭子,用9?11口齡SPF雞胚分離病毒,至少9只病毒分離陽性。1.2.1.5特異性用滅菌生理鹽水將毒種稀釋成含4HA單位的抗原液,分別與ND、EDS、H5亞型禽流感

4、、H7亞型禽流感陽性血清,SPF雞血清和H9亞型禽流感陽性血清作HI試驗,毒種對H9亞型禽流感陽性血清應(yīng)為陽性,對ND等其它陽性血清及SPF雞血清均應(yīng)為陰性。1.2.1.6免疫原性用生理鹽水將毒種作適半稀釋后,接種雞胚制備病毒抗原液,經(jīng)甲醛溶液滅活后,加油低劑制成油包水型滅活疫苗,按以下方法進行檢驗:1.2.1.6.1血清學方法用21?28H齡SPF雞15只,10只各頸部皮下或肌肉注射疫苗0?加1,另5只作對照。接種后21?28口,每只雞各采血,分離血清,用禽流感病毒H9亞型抗原測定HI抗體(見附注1和附注2)。免疫組HI抗

5、體效價的幾何平均值應(yīng)不小于6.51。創(chuàng),對照組HI抗體效價的兒何平均值應(yīng)不大于2.01og2o1.2.1.6.2免疫攻毒法用21?28口齡SPF雞15只,10只各頸部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml,另5只作對照。接種后21?28日,用1:10稀釋的AIVJY毒種進行翅靜脈注射,每只雞0.2mlo攻毒后第5H,分別采集每只雞的泄殖腔拭子,每個樣品經(jīng)尿囊腔接種9?11日齡SPF雞胚5枚,每胚0.2ml,孵育觀察5R,逐胚測定雞胚液的HA效價。每個樣品接種的5枚雞胚屮只要有1枚雞胚胚液的I【A效價:16(微量法),即可判為病毒分離陽

6、性。對病毒分離陰性的樣品,應(yīng)盲傳1次后再進行判定。免疫組應(yīng)至少有9只雞病毒分離陰性,對照組應(yīng)至少有4只雞病毒分離陽性。121.7純凈按現(xiàn)行《屮國獸藥典》附錄進行,應(yīng)無細菌、霉菌、支原體和外源病毒污染。1.2.1.8基礎(chǔ)種子代次E2?E8代。1.3毒種保存AIVJY株,在-20°C以下,保存期為24個月。2疫苗制造及半成品檢驗2.1生產(chǎn)用毒種的制備2.1.2ATV生產(chǎn)用毒種的制備。2丄2」AIV毒種繁殖用滅菌生理鹽水將毒種作10J至105稀釋,尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚,每胚0.1ml,選接種后48?96小時死亡且病痕明顯

7、的雞胚,分別收獲雞胚液(尿囊液及羊水),裝于滅菌容器內(nèi)。將檢驗無菌且對1%雞紅細胞懸液凝集價21:256的雞胚液混合,定量分裝,冷凍保存。注明收獲口期、毒種代數(shù)等。2」.2.2毒種鑒定按1.221、1.222及1.227項進行,應(yīng)符合規(guī)定。符合以上標準的毒種作為生產(chǎn)用種子。2.1.2.3毒種保存-70€以下保存,保存期為6個月。2.1.2.4毒種繼代應(yīng)不超過3代。2.2制苗材料的選擇選用發(fā)育良好的10?11日齡的健康易感雞胚。2.3制苗用毒液的制備2.3.2ATV病毒液的制備2.3.2.1接種取生產(chǎn)用毒種,用滅菌生理鹽水作適

8、半稀釋(如10“或10'稀釋),每胚尿囊腔內(nèi)接種0.lml,密封針孔,置36?37°C繼續(xù)孵育,不必翻蛋。2.3.2.2孵育和觀察接種后24小時內(nèi),每H照蛋1次,將24小吋內(nèi)死亡的雞胚棄去。此后,每4?6小時照1次,將死亡的雞胚隨時取出,直至120小時。120小時后雞胚不論死亡與否,將全部

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