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1、洋蔥atp6基因克隆和系統(tǒng)進(jìn)化研究 摘要：細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）在作物遺傳育種研究中占有重要地位，多種植物的細(xì)胞質(zhì)雄性不育均與線粒體基因結(jié)構(gòu)變異及新嵌合基因的產(chǎn)生有關(guān)。為探索線粒體atp6基因與洋蔥CMS的關(guān)系，以13份不育系和11份保持系為材料克隆洋蔥atp6基因編碼序列，測(cè)序結(jié)果表明不同材料atp6基因間存在一個(gè)C/A多態(tài)性位點(diǎn)，該多態(tài)性位點(diǎn)在不育系和保持系間隨機(jī)出現(xiàn)，而不是不育系與保持系的特征差異。蛋白質(zhì)分析表明這一多態(tài)性位點(diǎn)的變異并未改變atp6蛋白跨膜結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步的蛋白比對(duì)分析揭示了atp6蛋白在物種間有一定的保守性，特
2、別是第IV跨膜結(jié)構(gòu)域的Arg在所有物種中是高度保守的，也是H+轉(zhuǎn)運(yùn)所必需的?；赼tp6蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示細(xì)菌和病毒位于樹的基部，其次是真菌、低等藻類以及原生生物，然后高等藻類、苔蘚和蕨類，高等綠色開花植物處于樹的頂端，單子葉植物處于樹的最頂端。關(guān)鍵詞：洋蔥；雄性不育；atp6基因；系統(tǒng)進(jìn)化中圖分類號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）01-0010-059洋蔥（AlliumcepaL.）又名玉蔥、圓蔥、蔥頭等，起源于亞洲西部，屬于百合科蔥蒜屬二年生蔬菜，廣泛種植于世界各地。洋蔥于近代傳入我國(guó)，由于具
3、有適應(yīng)性強(qiáng)、耐貯藏和運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)，發(fā)展迅速。洋蔥是類黃酮的重要食物來(lái)源之一，對(duì)人體的健康有很大的影響，它具有廣泛的生物活性和重要的藥用價(jià)值，在防止心血管疾病、抗腫瘤、抗自由基、抗氧化、抗過(guò)敏、消炎、抗病毒等方面有重要作用[1]。洋蔥是最早利用雄性不育系育種的蔬菜作物之一，雄性不育的產(chǎn)生通常是由于線粒體基因的插入、缺失、重排等造成的基因突變以及形成新的嵌合基因[2]。在以往的研究中，此類基因主要為能量代謝相關(guān)蛋白（ATP、Cob、Cox和NAD/NADP）基因[3]。atp6基因是重要的線粒體功能基因，編碼F1F0-ATP合成酶系統(tǒng)中F0
4、部分最大亞基——A亞基[4]。目前已知水稻、油菜、蘿卜、大豆的雄性不育與atp6基因的突變有關(guān)[5～8]。前人的研究表明，在S（Sterile）型細(xì)胞質(zhì)與N/T（Normal）型細(xì)胞質(zhì)之間，atp6基因的編碼序列存在一個(gè)堿基的突變[9，10]，該突變是否是導(dǎo)致雄性不育的原因目前尚無(wú)定論。本研究克隆了洋蔥13個(gè)不育系與11個(gè)保持系的atp6基因，對(duì)其核酸和編碼蛋白序列進(jìn)行了生物信息學(xué)及進(jìn)化樹分析，以期通過(guò)單倍型的分布和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，探究atp6基因是否是導(dǎo)致洋蔥雄性不育的直接原因。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料9以13份雄性不育系（110
5、，118，502，503，101，117-5，117-11-1，117-10-1，117-10-2，117-10-3，L701，L702和L703）和11份保持系（210，218，602，603，202，217-5，217-11-1，217-10-1，217-10-2，217-10-3和L801）為材料進(jìn)行基因克隆[11]。洋蔥新鮮葉片采自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗(yàn)基地，取樣后迅速放入液氮中冷凍，于-80°C保存?zhèn)溆谩?.2洋蔥基因組總DNA的提取洋蔥基因組總DNA的提取采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen，北京）
6、，方法參照操作說(shuō)明書。1.3洋蔥atp6基因克隆本研究所用的上游引物P1：5′-ATGAGTGCTGAAAGTAGGAAAGAGTA-3′，下游引物P2：5′-TCAATGTTGATATGACTCATTTTGATG-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)總體積為25μl，其中模板（基因組DNA）1μl，2.5mmol/LdNTPs4μl，10×LATaqbuffer2.5μl，引物各1μl，TaKaRaLATaq0.25μl，用滅菌蒸餾水補(bǔ)齊至25μl。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火45s
7、，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃保溫10min，4℃保存。9PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照記錄。目的條帶用凝膠回收試劑盒（Tiangen，北京）回收，與克隆載體pMD18-T（寶生物，大連）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌液PCR鑒定后，將陽(yáng)性克隆送博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。1.4序列分析利用DNAMAN和Blast（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）進(jìn)行序列比對(duì)；SOPM
8、A（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）、TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/
