資源描述：
《DB32∕T 1774-2011 鴨H9 亞型禽流感病毒與副粘病毒的檢測(cè)雙重RT-PCR 方法.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、ICS65.020.30B41備案號(hào)：DBDBDBDB32323232江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T1774—2011鴨H9亞型禽流感病毒與副粘病毒的檢測(cè)雙重RT-PCR方法MethodofMultiplexRT-PCRdetectingH9SubtypeAvianInfluenzaVirus(AIV)andDuckParamyxovirus(DPV)2011-05-06發(fā)布2011-07-06實(shí)施江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB32/T1774—2011前言為規(guī)范鴨H9亞型禽流感病毒與鴨副粘病毒雙重RT-PCR分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，提高兩種病毒混合感染檢
2、測(cè)的靈敏度、穩(wěn)定性、特異性，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》編制。本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：魏雪濤、李銀、劉宇卓、張敬峰。IDB32/T1774—2011鴨H9亞型禽流感病毒與副粘病毒的檢測(cè)雙重RT-PCR方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范了鴨H9亞型禽流感病毒與副粘病毒分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)RT-PCR的所用引物大小、所涉及的樣品范圍、操作流程、反應(yīng)條件等技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于鴨H9亞型禽流感病毒與副粘病毒單獨(dú)或者混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷、臨床診斷、流行病
3、學(xué)調(diào)查、分離毒株的鑒定，適用于鴨組織、分泌物、排泄物和鴨胚尿囊液中H9亞型禽流感病毒和副粘病毒核酸的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T541-2002動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣方法NY/T772-2004禽流感病毒RT-PCR試驗(yàn)方法3原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)，簡(jiǎn)稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定
4、的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。PCR技術(shù)卻以其快速、敏感和特異等優(yōu)點(diǎn)在動(dòng)物疫病檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用，而且隨著PCR技術(shù)的不斷改進(jìn)，這種針對(duì)病原核酸的診斷方法表現(xiàn)出更準(zhǔn)確、靈敏和特異的特點(diǎn)。又因?yàn)殡p重RT-PCR技術(shù)具備1次PCR可以鑒別診斷2種混合感染的不同病原體的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為動(dòng)物病原檢測(cè)的重要方法之一。本標(biāo)準(zhǔn)參考了NY/T772-2004中H9AIV的檢測(cè)方法，并根據(jù)GenBank上公布的鴨副粘病毒（DPV）血凝素HA基因序列的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，保證了擴(kuò)增的準(zhǔn)確性，該方法可以同時(shí)鑒定兩種病毒的單一感染和混合感染。4
5、儀器設(shè)備與主要試劑4.1儀器設(shè)備：PCR儀，離心機(jī)，電泳槽，微量移液器，凝膠成像儀4.2主要試劑：TRIZOL，氯仿，異丙醇，無(wú)水乙醇，焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌雙蒸水，AMV反轉(zhuǎn)錄酶，5×AMVBuffer，10mmol/LdNTPs，RNA酶抑制劑，25mmol/LMgCl2，EXTaqDNA聚合酶，10×EXTaqDNA聚合酶buffer，2.5mmol/LdNTP，DNAMarkerDL-2000，瓊脂糖。5引物5.1反轉(zhuǎn)錄引物H9AIV：5′-AGCAAAAGCAGG-3′DPV：5′-GGAGGATGTTGGCAGCATT-3
6、′1DB32/T1774—20115.2PCR擴(kuò)增引物H9AIV:上游引物：5′-TCAACAAACTCCACCGAAACTGT-3′；下游引物：5′-TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA-3′。DPV：上游引物：5′-TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3′；下游引物：5′-GGAGGATGTTGGCAGCATT-3′6樣品采集按照NY/T541-2002，病死或撲殺鴨，取鴨肺臟、脾臟等組織；待檢活鴨用棉拭子蘸取氣管分泌物或者泄殖腔排泄物，置于50%甘油生理鹽水中。陰性對(duì)照：沒(méi)有發(fā)病的正常鴨肺臟、脾臟等組織陽(yáng)性對(duì)照：用陽(yáng)性抗體進(jìn)
7、行血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)的陽(yáng)性尿囊液7方法步驟試驗(yàn)用水：按照GB-T6682-2008三級(jí)水標(biāo)準(zhǔn)。7.1樣品處理取待檢病料0.5g～1g置研缽中剪碎并研磨，反復(fù)凍融研磨，將研磨好的組織用生理鹽水1︰5稀釋，稀釋液12000r/min離心10min，取上清200μL備用。分泌物和排泄物樣品的處理，將喉拭子或者泄殖腔拭子在50%甘油生理鹽水中充分捻動(dòng)、擠干后棄去拭子，4℃12000r/min離心10min，取上清200μL備用。7.2病毒RNA的提取取已處理的待檢樣品，以含H9亞型AIV、DPV和兩種病毒混合液為陽(yáng)性對(duì)照,以正常SPF雞胚尿囊液為陰性對(duì)照，
8、無(wú)菌水為空白對(duì)照，每管依次加入Trizol800μL，振蕩混勻后，室溫放置10min，加入氯仿200μL，劇烈振蕩后，室溫放置1min，
