神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)與分化調(diào)控研究進(jìn)展.doc

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1、神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)與分化調(diào)控研究進(jìn)展劉繼東①摘要白從神經(jīng)干細(xì)胞特別是成體神經(jīng)T細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，使人們看到利用神經(jīng)T?細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷的曙光。神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)以及分化調(diào)控一直是基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)，本文綜述了近年來這方面的研究成果，以對其有全面的了解，希望能對我們的研究工作有一定的幫助。關(guān)鍵詞干細(xì)胞神經(jīng)系統(tǒng)/細(xì)胞學(xué)分離培養(yǎng)調(diào)控［中圖分類號］R329［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］A長期以來，普遍認(rèn)為哺乳動物的再生僅限于胚胎時期，這意味著成年動物腦和脊髓內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞只能逐漸減少而不能被更新或替代。然而，屮樞神經(jīng)細(xì)胞再生現(xiàn)象及具有增殖能力的神經(jīng)T?細(xì)胞再生現(xiàn)象及具有增殖能力的神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)

2、現(xiàn)向這-?理論提出了挑戰(zhàn)?，F(xiàn)在己經(jīng)從胎鼠、成年鼠、胎兒和成人腦的皮層、室管膜下層、紋狀體、海馬、中腦、前腦、等腦區(qū)和脊髓分離得到了NSCo由于保持了未分化狀態(tài)并具有增殖能力，因此移植NSC治療神經(jīng)退行性疾病引起了人們極人的興趣。然而，由于神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)分化成為各種神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制十分復(fù)雜，對于神經(jīng)干細(xì)胞受控分化為所需成熟神經(jīng)細(xì)胞的研究十分熱烈，本文綜述了近年來神經(jīng)干細(xì)胞在分離培養(yǎng)分化調(diào)控的研究進(jìn)展，以對其有更全面的了解。1神經(jīng)干細(xì)胞的生物學(xué)特征干細(xì)胞研究始與本世紀(jì)60年代，造血干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)使人們對干細(xì)胞的特點(diǎn)有了一?些初步的了解。近年來，隨著生物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展

3、，該領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展，被?science?雜志評為2000年十大科學(xué)成就之一。T?細(xì)胞是一種未分化細(xì)胞，其基本特性為，第一具有白我復(fù)制能力，第二可分化為超過一種以上的功能細(xì)胞。根據(jù)分化潛能的大小，可將之分為3類，一是全能干細(xì)胞，即受精卵，受精后的第1小時內(nèi)，受精束可分裂為功能一致的全能細(xì)胞，將其屮的任一細(xì)胞置于女性子宮內(nèi)均可發(fā)育為胎兒；二是胚胎干細(xì)胞，它具有廣泛的分化潛能，可生成除胎盤外機(jī)體所有的組織細(xì)胞；三是多能T細(xì)胞，它局限于器官的某些特定部位，可分化為所在組織的細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞是位于神經(jīng)系統(tǒng)的多能干細(xì)胞。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，屮樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞是一種終末細(xì)胞

4、，即細(xì)胞處于有絲分裂厲狀態(tài)，缺乏再生能力。創(chuàng)傷和病理過程引起的神經(jīng)原丟失絲-?個不可逆的過程。近年來神經(jīng)干細(xì)胞研究的迅猛發(fā)展使這一概念而臨重人修正?，F(xiàn)已證實(shí)，NSC不僅存在于胚胎神經(jīng)系統(tǒng)，也存在于成年腦的某些特定部位，如海馬、紋狀體、室下核等處，干細(xì)胞及分化的最終產(chǎn)物表達(dá)不同的抗原標(biāo)記，可以此監(jiān)測細(xì)胞所處的分化狀態(tài)。關(guān)于成年神經(jīng)系統(tǒng)終干細(xì)胞的功能，現(xiàn)在還不十分的明確，一般認(rèn)為，它們很可能與認(rèn)知功能有關(guān)，室神經(jīng)系統(tǒng)可蜩性的基礎(chǔ)。具體的說就是在某些外界環(huán)境的影響下，干細(xì)胞在局部生成的新神經(jīng)原可以參加記憶的形成和整合，即人腦控制行為，行為乂可以反過來影響犬腦的結(jié)構(gòu)⑴。人

5、們對神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)的成功，為神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)和退行性病變的治療帶來了新的希望。1=1前對神經(jīng)干細(xì)胞的研究已經(jīng)形成了兩個方向：一?是神經(jīng)干細(xì)胞增值分化以后將其移植，二是借助于投入細(xì)胞因子等方法將體內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞激活，分化形成神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞，但由于外科手術(shù)和研究條件的限制,尤其是人們對于人神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特性知之其少，因此神經(jīng)干細(xì)胞的研究主要轉(zhuǎn)向體外實(shí)驗(yàn)，用分離擴(kuò)增的神經(jīng)干細(xì)胞或?qū)⑵浞只筮M(jìn)行移植，但這些干細(xì)胞是否與其在體內(nèi)壞境時具有同樣的能力，口前還所知其少。只有獲得高純度的神經(jīng)干細(xì)胞并使其永生化將是今厲研究的難點(diǎn)。2神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)一直沒有特定的程序

6、運(yùn)用于原代培養(yǎng)分離神經(jīng)干細(xì)胞,日前主要依賴于神經(jīng)干細(xì)胞對存在于無血淸培養(yǎng)液中的絲裂原的感應(yīng)能力來擴(kuò)增，而其它的原代細(xì)胞在這種培養(yǎng)液中不易存活。基于這一特點(diǎn)，1992年Rreynolds和Weiss在EGF存在的條件卜，利用Neurosphere法從成鼠紋狀體成功分離得到了神經(jīng)干細(xì)胞。此厲，研究者紛紛利用該法成功地在體外分離、提純、擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)。2.1有限稀釋法分離神經(jīng)T細(xì)胞這是目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所采用的方法。在活體動物屮樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)己被確定有神經(jīng)T?細(xì)胞的部位切取部分組織，機(jī)械或消化后分離成單細(xì)胞懸液(2X108?L?1),在含有高濃度有絲分

7、昆明醫(yī)學(xué)院裂原(EGF和bFGF)的無血淸培養(yǎng)基屮孵育淇中一部分細(xì)胞增殖形成球形細(xì)胞團(tuán)即Neurosphere,S些細(xì)胞團(tuán)呈Nestin(神經(jīng)干細(xì)胞特異蛋片?巢蛋片)陽性,具有分化為屮樞神經(jīng)系統(tǒng)的3種主要細(xì)胞，即神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的潛能。7d后經(jīng)機(jī)械分離使細(xì)胞球再次分離成為單細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)，-?般以1X107?L?1細(xì)胞數(shù)接種在24孔培養(yǎng)板屮,7d片再次分離細(xì)胞球，以1?2個細(xì)胞/u1接種在96孔培養(yǎng)板屮，倒置相差顯微鏡下觀察并標(biāo)記含有單個活細(xì)胞的孔,7d后標(biāo)記所有含細(xì)胞球的孔,搜集細(xì)胞球再次將細(xì)胞球分離成單細(xì)胞,接種于24孔板中，如此反復(fù)傳代，可

8、獲得較高純